Team:Heidelberg/InterLab

Interlab

1. Interlab Study

As a first step to contribute to this year's iGEM competition we decided to participate in iGEM's fourth International Interlaboratory Study along with many other teams from around the world. This study is organized by iGEM's measurement committee in an effort to establish standardized, reliable and repeatable measurement tools for the iGEM community and the synthetic biology community as a whole. This year's iGEM InterLab study is about establishing a standardized protocol for the measurement of GFP using a plate reader. To start things off we needed a plate reader that is qualified to measure GFP fluorescence. Namely, Tecan Infinite M200 Pro plate reader. Additionally, we needed competent E.coli DH5α. These were prepared from glycerol stocks. Together with the material iGEM had provided we were ready for work. Throughout our experiments, we tested 8 plasmids (2 controls and 6 test devices) by measuring the OD600 and the fluorescence of the cells carrying the constructs. The workflow can be separated into four segments. The first segment is the transformation of all plasmids into competent DH5α cells.

1.1 Transformation of 8 test devices into competent DH5α cells

The transformation was successful for all the plasmids and resulted in a sufficient amount of colonies on all plates. Therefore, two colonies from each plate were picked and inoculated in LB medium containing chloramphenicol overnight for approximately 16-18 hours at 37°C and 220 rpm.

1.2 Measurement of LUDOX-HS40 OD600 Reference Point

The second segment is the measurement of the LUDOX-HS40 solution to obtain a ratiometric conversion factor which allows us to transform the absorbance data into a standard OD600 measurement. This is necessary because plate readers, in general, do not have a 1 cm path length which means that measurements are volume dependent. By doing so, we obtained following data.

Table 1: With these replicates measured, we obtained a ratiometric conversion factor of 4.30 for our specific plate reader when measured 100 μL of the provided LUDOX-HS40 to water.

LUDOX-HS40 H2O
Replicate
1		 0,0543 0,0424
Replicate
2		 0,0508 0,0413
Replicate
3		 0,0515 0,0424
Replicate
4		 0,051 0,042
Arith.
Mean		 0,0519 0,042
Corrected
Abs600		 0,009875
Reference
OD600		 0,0425
OD600/Abs600 4,303797

1.3 Graphing a Fluorescein fluorescence standard curve

In the third segment, we were instructed to measure a standard curve for fluorescence of Fluorescein which can be used to correct our cell-based readings to an equivalent Fluorescein concentration. Following the instructions, we could obtain following results for the serial dilution of Fluorescein in phosphate buffered saline.

Table 2:

uM Fluorescein 50,00 25 12,5 6,25 3,125 1,5625 0,7813 0,3906 0,1953 0,0977 0,0488 0
Replicate 1 43791 28969 17384 9562 5001 2591 1355 676 344 173 87 3
Replicate 2 44517 29931 17243 9266 5010 2575 1325 668 324 170 84 2
Replicate 3 42992 28755 17684 10262 5451 2851 1439 733 369 184 91 2
Replicate 4 42990 28734 17280 9617 5261 2667 1381 696 337 178 90 5
Arith. Mean 43573 29097 17398 9676,8 5180,8 2671 1375 693,25 343,5 176,25 88 3
Arith. Std.Dev. 733,96 565,88 199,95 419,51 216,75 126,53 48,415 28,999 18,912 6,1305 3,1623 1,4142

Table 3:

uM
Fluorescein/a.u.		 50,00 25 12,5 6,25 3,125 1,5625 0,7813 0,3906 0,1953 0,0977 0,0488
Mean uM Fluorescein/a.u. 0,0011 0,0009 0,0007 0,0006 0,0006 0,0006 0,0006 0,0006 0,0006 0,0006 0,0006
Mean of
med-high levels:		 0,0007
Figure 1.1:
Fluorescence is plotted against the Fluorescein concentration
Figure 1.2:
Fluorescence is plotted against the Fluorescein concentration on a logarithmic scale
These data give us an approximate linear regression line when plotted on a logarithmic scale and show an expected exponential course when plotted in a linear form.

1.4 Measurement of OD600 and Fluorescence of Transformed Cells

In the last of the four segments, the OD600 and the fluorescence of the transformed cells were measured according to the protocol after 0, 2, 4 and 6 hours. Measurements of all these time points gave us the following data and calculations which were conducted with the values we obtained from the standard curves and the reference point.

Table 4:

Fluorescence Raw Readings: Abs600Raw Readings:
Hour 0: Neg. Control Pos. Control Device 1 Device 2 Device 3 Device 4 Device 5 Device 6 LB + Chlor (blank) Hour 0: Neg. Control Pos. Control Device 1 Device 2 Device 3 Device 4 Device 5 Device 6 LB + Chlor (blank)
Colony 1, Replicate 1 228 262 294 371 227 275 249 230 221 Colony 1, Replicate 1 0,0473 0,0467 0,0478 0,0493 0,0483 0,0486 0,0474 0,0456 0,0435
Colony 1, Replicate 2 222 298 270 302 214 271 237 230 242 Colony 1, Replicate 2 0,0459 0,0466 0,0464 0,0468 0,0471 0,0474 0,0459 0,0442 0,043
Colony 1, Replicate 3 196 265 269 285 227 268 231 219 205 Colony 1, Replicate 3 0,05 0,0499 0,0502 0,0503 0,0518 0,0513 0,0502 0,0479 0,0473
Colony 1, Replicate 4 227 302 285 312 225 272 244 232 235 Colony 1, Replicate 4 0,061 0,0667 0,0691 0,0714 0,0725 0,0709 0,0596 0,0624 0,0412
Colony 2, Replicate 1 226 258 297 287 230 284 255 221 221 Colony 2, Replicate 1 0,0473 0,0471 0,0504 0,0484 0,0482 0,0482 0,0496 0,0482 0,0474
Colony 2, Replicate 2 217 277 301 311 221 283 244 244 231 Colony 2, Replicate 2 0,0469 0,0472 0,0492 0,0485 0,0473 0,047 0,0479 0,0474 0,0477
Colony 2, Replicate 3 213 261 287 285 222 276 236 225 234 Colony 2, Replicate 3 0,0512 0,0499 0,0563 0,0527 0,052 0,0523 0,0539 0,0533 0,0521
Colony 2, Replicate 4 223 267 294 303 224 293 249 238 243 Colony 2, Replicate 4 0,0604 0,0696 0,0686 0,0617 0,0719 0,0714 0,0608 0,0611 0,0646
Hour 2: Neg. Control Pos. Control Device 1 Device 2 Device 3 Device 4 Device 5 Device 6 LB + Chlor (blank) Hour 2: Neg. Control Pos. Control Device 1 Device 2 Device 3 Device 4 Device 5 Device 6 LB + Chlor (blank)
Colony 1, Replicate 1 234 841 916 973 241 640 740 242 222 Colony 1, Replicate 1 0,0652 0,0568 0,0599 0,0613 0,068 0,0521 0,0742 0,075 0,0465
Colony 1, Replicate 2 229 850 864 923 234 608 641 239 239 Colony 1, Replicate 2 0,06 0,0539 0,0569 0,057 0,0632 0,0496 0,0671 0,0713 0,0455
Colony 1, Replicate 3 230 741 810 897 236 551 545 254 236 Colony 1, Replicate 3 0,0671 0,057 0,0626 0,0637 0,0671 0,0547 0,0698 0,0754 0,0515
Colony 1, Replicate 4 227 758 942 893 240 564 613 241 240 Colony 1, Replicate 4 0,081 0,0695 0,082 0,0799 0,0833 0,0674 0,0836 0,085 0,0409
Colony 2, Replicate 1 233 913 1016 1045 246 521 661 244 215 Colony 2, Replicate 1 0,0667 0,0602 0,062 0,065 0,0704 0,0499 0,0729 0,0774 0,0491
Colony 2, Replicate 2 224 784 878 893 243 702 642 233 254 Colony 2, Replicate 2 0,0608 0,0558 0,0568 0,0592 0,0654 0,052 0,068 0,0721 0,0452
Colony 2, Replicate 3 217 712 765 877 228 597 571 219 232 Colony 2, Replicate 3 0,0642 0,0614 0,0624 0,0669 0,0719 0,0584 0,0732 0,0676 0,053
Colony 2, Replicate 4 227 706 748 904 237 598 576 252 247 Colony 2, Replicate 4 0,0684 0,057 0,071 0,0803 0,0959 0,0653 0,0843 0,0848 0,0732
Hour 4: Neg. Control Pos. Control Device 1 Device 2 Device 3 Device 4 Device 5 Device 6 LB + Chlor (blank) Hour 4: Neg. Control Pos. Control Device 1 Device 2 Device 3 Device 4 Device 5 Device 6 LB + Chlor (blank)
Colony 1, Replicate 1 265 3725 4330 4534 327 1619 1493 293 224 Colony 1, Replicate 1 0,1765 0,1449 0,1431 0,1661 0,1677 0,0692 0,1766 0,193 0,047
Colony 1, Replicate 2 269 3980 3936 4087 334 1489 1551 275 229 Colony 1, Replicate 2 0,1804 0,1515 0,1365 0,1585 0,1861 0,07 0,19 0,167 0,0469
Colony 1, Replicate 3 245 2579 3110 3080 300 1280 1257 276 238 Colony 1, Replicate 3 0,1321 0,1194 0,1199 0,132 0,1482 0,0666 0,1573 0,1578 0,0516
Colony 1, Replicate 4 247 2934 3253 3214 313 1543 1358 304 234 Colony 1, Replicate 4 0,1354 0,1348 0,1296 0,1441 0,1762 0,0885 0,164 0,189 0,0456
Colony 2, Replicate 1 269 3980 3936 4087 334 1489 1551 275 229 Colony 2, Replicate 1 0,3007 0,2746 0,2586 0,308 0,3246 0,339 0,3438 0,3446 0,0473
Colony 2, Replicate 2 253 2825 3064 3547 321 1619 1294 308 237 Colony 2, Replicate 2 0,1467 0,1192 0,1135 0,1373 0,1643 0,0698 0,151 0,1849 0,0453
Colony 2, Replicate 3 249 3397 3055 3125 309 1516 1238 276 239 Colony 2, Replicate 3 0,1374 0,1356 0,1199 0,1344 0,1453 0,0763 0,1532 0,1626 0,0536
Colony 2, Replicate 4 261 2585 3302 3124 322 1589 1285 292 246 Colony 2, Replicate 4 0,1423 0,1255 0,138 0,1527 0,1686 0,0765 0,1522 0,1622 0,064
Hour 6: Neg. Control Pos. Control Device 1 Device 2 Device 3 Device 4 Device 5 Device 6 LB + Chlor (blank) Hour 6: Neg. Control Pos. Control Device 1 Device 2 Device 3 Device 4 Device 5 Device 6 LB + Chlor (blank)
Colony 1, Replicate 1 289 7046 9753 10223 429 4924 5031 328 223 Colony 1, Replicate 1 0,2911 0,2572 0,2697 0,2843 0,311 0,1557 0,1581 0,3271 0,0473
Colony 1, Replicate 2 290 7161 9621 9685 429 4659 4916 322 233 Colony 1, Replicate 2 0,2735 0,2467 0,2558 0,2596 0,2984 0,1439 0,1471 0,3082 0,0492
Colony 1, Replicate 3 284 6900 8983 9620 420 4563 4830 335 236 Colony 1, Replicate 3 0,2694 0,2542 0,2557 0,2671 0,2856 0,1464 0,1531 0,3093 0,052
Colony 1, Replicate 4 320 7664 10384 10759 441 5092 5472 341 239 Colony 1, Replicate 4 0,3314 0,2762 0,2711 0,2787 0,2999 0,1738 0,1763 0,2938 0,0401
Colony 2, Replicate 1 285 7246 9059 10726 445 2372 2368 332 229 Colony 2, Replicate 1 0,3007 0,2746 0,2586 0,308 0,3246 0,339 0,3438 0,3446 0,0473
Colony 2, Replicate 2 286 7418 10409 10079 442 2357 2321 329 232 Colony 2, Replicate 2 0,2853 0,2574 0,2783 0,2668 0,2989 0,3188 0,3134 0,3161 0,0513
Colony 2, Replicate 3 285 6939 9332 10013 439 2297 2299 336 232 Colony 2, Replicate 3 0,282 0,2546 0,2629 0,2691 0,3006 0,3064 0,3063 0,3094 0,0538
Colony 2, Replicate 4 294 7882 9938 10980 446 2523 2513 330 253 Colony 2, Replicate 4 0,2851 0,2633 0,2614 0,2668 0,2911 0,3239 0,336 0,3191 0,0469

Table 5:

Unit
Scaling Factors:
OD600/Abs600 4,30
uM Fluorescein/a.u. 6,82E-04

Table 6:

Experimental
Values:		 Raw Abs600 Raw
Fluorescence
Sample set: Replicate 1 Replicate 2 Replicate 3 Replicate 4 Replicate 1 Replicate 2 Replicate 3 Replicate 4
Blank media 0,0435 0,043 0,0473 0,0412 221 242 205 235
Blank mean: 0,04375 225,75 OD - Background Fluorescence - Background uM Fluorescein / OD600 Summary Statistics
Hour 0: Replicate 1 Replicate 2 Replicate 3 Replicate 4 Replicate 1 Replicate 2 Replicate 3 Replicate 4 Replicate 1 Replicate 2 Replicate 3 Replicate 4 Arith. Mean Arith. Std.Dev. Geo. Mean Geo. Std. Dev.
Negative Control (Colony 1) 0,0473 0,0459 0,05 0,061 228 222 196 227 0,00355 0,00215 0,00625 0,01725 2,25 -3,75 -29,75 1,25 0,10 -0,28 -0,75 0,01 -0,23 0,39
Negative Control (Colony 2) 0,0473 0,0469 0,0512 0,0604 226 217 213 223 0,00355 0,00315 0,00745 0,01665 0,25 -8,75 -12,75 -2,75 0,01 -0,44 -0,27 -0,03 -0,18 0,21
Positive Control (Colony 1) 0,0467 0,0466 0,0499 0,0667 262 298 265 302 0,00295 0,00285 0,00615 0,02295 36,25 72,25 39,25 76,25 1,95 4,02 1,01 0,53 1,88 1,55 1,43 2,391
Positive Control (Colony 2) 0,0471 0,0472 0,0499 0,0696 258 277 261 267 0,00335 0,00345 0,00615 0,02585 32,25 51,25 35,25 41,25 1,53 2,36 0,91 0,25 1,26 0,90 0,95 2,628
Test Device 1: J23101.BCD2.E0040.B0015
(Colony 1)		 0,0478 0,0464 0,0502 0,0691 294 270 269 285 0,00405 0,00265 0,00645 0,02535 68,25 44,25 43,25 59,25 2,67 2,65 1,06 0,37 1,69 1,16 1,29 2,555
Test Device 1: J23101.BCD2.E0040.B0015
(Colony 2)		 0,0504 0,0492 0,0563 0,0686 297 301 287 294 0,00665 0,00545 0,01255 0,02485 71,25 75,25 61,25 68,25 1,70 2,19 0,77 0,44 1,27 0,81 1,06 2,094
Test Device 2: J23106.BCD2.E0040.B0015
(Colony 1)		 0,0493 0,0468 0,0503 0,0714 371 302 285 312 0,00555 0,00305 0,00655 0,02765 145,25 76,25 59,25 86,25 4,15 3,96 1,43 0,49 2,51 1,83 1,85 2,736
Test Device 2: J23106.BCD2.E0040.B0015
(Colony 2)		 0,0484 0,0485 0,0527 0,0617 287 311 285 303 0,00465 0,00475 0,00895 0,01795 61,25 85,25 59,25 77,25 2,09 2,85 1,05 0,68 1,67 0,99 1,44 1,912
Test Device 3: J23117.BCD2.E0040.B0015
(Colony 1)		 0,0483 0,0471 0,0518 0,0725 227 214 227 225 0,00455 0,00335 0,00805 0,02875 1,25 -11,75 1,25 -0,75 0,04 -0,56 0,02 0,00 -0,12 0,29
Test Device 3: J23117.BCD2.E0040.B0015
(Colony 2)		 0,0482 0,0473 0,052 0,0719 230 221 222 224 0,00445 0,00355 0,00825 0,02815 4,25 -4,75 -3,75 -1,75 0,15 -0,21 -0,07 -0,01 -0,04 0,15
Test Device 4: J23101+I13504 (Colony 1) 0,0486 0,0474 0,0513 0,0709 275 271 268 272 0,00485 0,00365 0,00755 0,02715 49,25 45,25 42,25 46,25 1,61 1,97 0,89 0,27 1,18 0,76 0,93 2,442
Test Device 4: J23101+I13504 (Colony 2) 0,0482 0,047 0,0523 0,0714 284 283 276 293 0,00445 0,00325 0,00855 0,02765 58,25 57,25 50,25 67,25 2,08 2,79 0,93 0,39 1,55 1,09 1,20 2,431
Test Device 5: J23106+I13504 (Colony 1) 0,0474 0,0459 0,0502 0,0596 249 237 231 244 0,00365 0,00215 0,00645 0,01585 23,25 11,25 5,25 18,25 1,01 0,83 0,13 0,18 0,54 0,45 0,37 2,840
Test Device 5: J23106+I13504 (Colony 2) 0,0496 0,0479 0,0539 0,0608 255 244 236 249 0,00585 0,00415 0,01015 0,01705 29,25 18,25 10,25 23,25 0,79 0,70 0,16 0,22 0,47 0,32 0,37 2,250
Test Device 6: J23117+I13504 (Colony 1) 0,0456 0,0442 0,0479 0,0624 230 230 219 232 0,00185 0,00045 0,00415 0,01865 4,25 4,25 -6,75 6,25 0,36 1,50 -0,26 0,05 0,41 0,77
Test Device 6: J23117+I13504 (Colony 2) 0,0482 0,0474 0,0533 0,0611 221 244 225 238 0,00445 0,00365 0,00955 0,01735 -4,75 18,25 -0,75 12,25 -0,17 0,79 -0,01 0,11 0,18 0,42
Hour 2:
Negative Control (Colony 1) 0,0652 0,06 0,0671 0,081 234 229 230 227 0,02145 0,01625 0,02335 0,03725 8,25 3,25 4,25 1,25 0,06 0,03 0,03 0,01 0,03 0,02 0,02 2,830
Negative Control (Colony 2) 0,0667 0,0608 0,0642 0,0684 233 224 217 227 0,02295 0,01705 0,02045 0,02465 7,25 -1,75 -8,75 1,25 0,05 -0,02 -0,07 0,01 -0,01 0,05
Positive Control (Colony 1) 0,0568 0,0539 0,057 0,0695 841 850 741 758 0,01305 0,01015 0,01325 0,02575 615,25 624,25 515,25 532,25 7,47 9,75 6,17 3,28 6,67 2,70 6,19 1,591
Positive Control (Colony 2) 0,0602 0,0558 0,0614 0,057 913 784 712 706 0,01645 0,01205 0,01765 0,01325 687,25 558,25 486,25 480,25 6,62 7,35 4,37 5,75 6,02 1,28 5,91 1,253
Test Device 1: J23101.BCD2.E0040.B0015
(Colony 1)		 0,0599 0,0569 0,0626 0,082 916 864 810 942 0,01615 0,01315 0,01885 0,03825 690,25 638,25 584,25 716,25 6,78 7,70 4,91 2,97 5,59 2,09 5,25 1,529
Test Device 1: J23101.BCD2.E0040.B0015
(Colony 2)		 0,062 0,0568 0,0624 0,071 1016 878 765 748 0,01825 0,01305 0,01865 0,02725 790,25 652,25 539,25 522,25 6,87 7,92 4,58 3,04 5,60 2,21 5,25 1,540
Test Device 2: J23106.BCD2.E0040.B0015
(Colony 1)		 0,0613 0,057 0,0637 0,0799 973 923 897 893 0,01755 0,01325 0,01995 0,03615 747,25 697,25 671,25 667,25 6,75 8,34 5,33 2,93 5,84 2,30 5,45 1,572
Test Device 2: J23106.BCD2.E0040.B0015
(Colony 2)		 0,065 0,0592 0,0669 0,0803 1045 893 877 904 0,02125 0,01545 0,02315 0,03655 819,25 667,25 651,25 678,25 6,11 6,85 4,46 2,94 5,09 1,75 4,84 1,460
Test Device 3: J23117.BCD2.E0040.B0015
(Colony 1)		 0,068 0,0632 0,0671 0,0833 241 234 236 240 0,02425 0,01945 0,02335 0,03955 15,25 8,25 10,25 14,25 0,10 0,07 0,07 0,06 0,07 0,02 0,07 1,265
Test Device 3: J23117.BCD2.E0040.B0015
(Colony 2)		 0,0704 0,0654 0,0719 0,0959 246 243 228 237 0,02665 0,02165 0,02815 0,05215 20,25 17,25 2,25 11,25 0,12 0,13 0,01 0,03 0,07 0,06 0,05 3,018
Test Device 4: J23101+I13504 (Colony 1) 0,0521 0,0496 0,0547 0,0674 640 608 551 564 0,00835 0,00585 0,01095 0,02365 414,25 382,25 325,25 338,25 7,87 10,36 4,71 2,27 6,30 3,55 5,43 1,950
Test Device 4: J23101+I13504 (Colony 2) 0,0499 0,052 0,0584 0,0653 521 702 597 598 0,00615 0,00825 0,01465 0,02155 295,25 476,25 371,25 372,25 7,61 9,15 4,02 2,74 5,88 3,00 5,26 1,751
Test Device 5: J23106+I13504 (Colony 1) 0,0742 0,0671 0,0698 0,0836 740 641 545 613 0,03045 0,02335 0,02605 0,03985 514,25 415,25 319,25 387,25 2,68 2,82 1,94 1,54 2,25 0,61 2,18 1,329
Test Device 5: J23106+I13504 (Colony 2) 0,0729 0,068 0,0732 0,0843 661 642 571 576 0,02915 0,02425 0,02945 0,04055 435,25 416,25 345,25 350,25 2,37 2,72 1,86 1,37 2,08 0,59 2,01 1,351
Test Device 6: J23117+I13504 (Colony 1) 0,075 0,0713 0,0754 0,085 242 239 254 241 0,03125 0,02755 0,03165 0,04125 16,25 13,25 28,25 15,25 0,08 0,08 0,14 0,06 0,09 0,04 0,08 1,448
Test Device 6: J23117+I13504 (Colony 2) 0,0774 0,0721 0,0676 0,0848 244 233 219 252 0,03365 0,02835 0,02385 0,04105 18,25 7,25 -6,75 26,25 0,09 0,04 -0,04 0,10 0,05 0,07
Hour 4:
Negative Control (Colony 1) 0,1765 0,1804 0,1321 0,1354 265 269 245 247 0,13275 0,13665 0,08835 0,09165 39,25 43,25 19,25 21,25 0,05 0,05 0,03 0,04 0,04 0,01 0,04 1,199
Negative Control (Colony 2) 0,3007 0,1467 0,1374 0,1423 269 253 249 261 0,25695 0,10295 0,09365 0,09855 43,25 27,25 23,25 35,25 0,03 0,04 0,04 0,06 0,04 0,01 0,04 1,363
Positive Control (Colony 1) 0,1449 0,1515 0,1194 0,1348 3725 3980 2579 2934 0,10115 0,10775 0,07565 0,09105 3499,25 3754,25 2353,25 2708,25 5,48 5,52 4,93 4,72 5,16 0,40 5,15 1,082
Positive Control (Colony 2) 0,2746 0,1192 0,1356 0,1255 3980 2825 3397 2585 0,23085 0,07545 0,09185 0,08175 3754,25 2599,25 3171,25 2359,25 2,58 5,46 5,47 4,58 4,52 1,36 4,33 1,428
Test Device 1: J23101.BCD2.E0040.B0015
(Colony 1)		 0,1431 0,1365 0,1199 0,1296 4330 3936 3110 3253 0,09935 0,09275 0,07615 0,08585 4104,25 3710,25 2884,25 3027,25 6,55 6,34 6,01 5,59 6,12 0,42 6,11 1,072
Test Device 1: J23101.BCD2.E0040.B0015
(Colony 2)		 0,2586 0,1135 0,1199 0,138 3936 3064 3055 3302 0,21485 0,06975 0,07615 0,09425 3710,25 2838,25 2829,25 3076,25 2,74 6,45 5,89 5,17 5,06 1,64 4,82 1,473
Test Device 2: J23106.BCD2.E0040.B0015
(Colony 1)		 0,1661 0,1585 0,132 0,1441 4534 4087 3080 3214 0,12235 0,11475 0,08825 0,10035 4308,25 3861,25 2854,25 2988,25 5,58 5,33 5,13 4,72 5,19 0,36 5,18 1,074
Test Device 2: J23106.BCD2.E0040.B0015
(Colony 2)		 0,308 0,1373 0,1344 0,1527 4087 3547 3125 3124 0,26425 0,09355 0,09065 0,10895 3861,25 3321,25 2899,25 2898,25 2,32 5,63 5,07 4,22 4,31 1,45 4,09 1,487
Test Device 3: J23117.BCD2.E0040.B0015
(Colony 1)		 0,1677 0,1861 0,1482 0,1762 327 334 300 313 0,12395 0,14235 0,10445 0,13245 101,25 108,25 74,25 87,25 0,13 0,12 0,11 0,10 0,12 0,01 0,12 1,096
Test Device 3: J23117.BCD2.E0040.B0015
(Colony 2)		 0,3246 0,1643 0,1453 0,1686 334 321 309 322 0,28085 0,12055 0,10155 0,12485 108,25 95,25 83,25 96,25 0,06 0,13 0,13 0,12 0,11 0,03 0,11 1,436
Test Device 4: J23101+I13504 (Colony 1) 0,0692 0,07 0,0666 0,0885 1619 1489 1280 1543 0,02545 0,02625 0,02285 0,04475 1393,25 1263,25 1054,25 1317,25 8,68 7,63 7,31 4,67 7,07 1,71 6,90 1,310
Test Device 4: J23101+I13504 (Colony 2) 0,339 0,0698 0,0763 0,0765 1489 1619 1516 1589 0,29525 0,02605 0,03255 0,03275 1263,25 1393,25 1290,25 1363,25 0,68 8,48 6,28 6,60 5,51 3,36 3,93 3,250
Test Device 5: J23106+I13504 (Colony 1) 0,1766 0,19 0,1573 0,164 1493 1551 1257 1358 0,13285 0,14625 0,11355 0,12025 1267,25 1325,25 1031,25 1132,25 1,51 1,44 1,44 1,49 1,47 0,04 1,47 1,026
Test Device 5: J23106+I13504 (Colony 2) 0,3438 0,151 0,1532 0,1522 1551 1294 1238 1285 0,30005 0,10725 0,10945 0,10845 1325,25 1068,25 1012,25 1059,25 0,70 1,58 1,47 1,55 1,32 0,42 1,26 1,480
Test Device 6: J23117+I13504 (Colony 1) 0,193 0,167 0,1578 0,189 293 275 276 304 0,14925 0,12325 0,11405 0,14525 67,25 49,25 50,25 78,25 0,07 0,06 0,07 0,09 0,07 0,01 0,07 1,133
Test Device 6: J23117+I13504 (Colony 2) 0,3446 0,1849 0,1626 0,1622 275 308 276 292 0,30085 0,14115 0,11885 0,11845 49,25 82,25 50,25 66,25 0,03 0,09 0,07 0,09 0,07 0,03 0,06 1,807
Hour 6:
Negative Control (Colony 1) 0,2911 0,2735 0,2694 0,3314 289 290 284 320 0,24735 0,22975 0,22565 0,28765 63,25 64,25 58,25 94,25 0,04 0,04 0,04 0,05 0,04 0,01 0,04 1,122
Negative Control (Colony 2) 0,3007 0,2853 0,282 0,2851 285 286 285 294 0,25695 0,24155 0,23825 0,24135 59,25 60,25 59,25 68,25 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,00 0,04 1,088
Positive Control (Colony 1) 0,2572 0,2467 0,2542 0,2762 7046 7161 6900 7664 0,21345 0,20295 0,21045 0,23245 6820,25 6935,25 6674,25 7438,25 5,07 5,42 5,03 5,07 5,15 0,18 5,14 1,035
Positive Control (Colony 2) 0,2746 0,2574 0,2546 0,2633 7246 7418 6939 7882 0,23085 0,21365 0,21085 0,21955 7020,25 7192,25 6713,25 7656,25 4,82 5,34 5,05 5,53 5,18 0,31 5,18 1,062
Test Device 1: J23101.BCD2.E0040.B0015
(Colony 1)		 0,2697 0,2558 0,2557 0,2711 9753 9621 8983 10384 0,22595 0,21205 0,21195 0,22735 9527,25 9395,25 8757,25 10158,25 6,69 7,02 6,55 7,08 6,84 0,26 6,83 1,039
Test Device 1: J23101.BCD2.E0040.B0015
(Colony 2)		 0,2586 0,2783 0,2629 0,2614 9059 10409 9332 9938 0,21485 0,23455 0,21915 0,21765 8833,25 10183,25 9106,25 9712,25 6,52 6,88 6,59 7,07 6,77 0,26 6,76 1,039
Test Device 2: J23106.BCD2.E0040.B0015
(Colony 1)		 0,2843 0,2596 0,2671 0,2787 10223 9685 9620 10759 0,24055 0,21585 0,22335 0,23495 9997,25 9459,25 9394,25 10533,25 6,59 6,95 6,67 7,11 6,83 0,24 6,83 1,036
Test Device 2: J23106.BCD2.E0040.B0015
(Colony 2)		 0,308 0,2668 0,2691 0,2668 10726 10079 10013 10980 0,26425 0,22305 0,22535 0,22305 10500,25 9853,25 9787,25 10754,25 6,30 7,00 6,89 7,64 6,96 0,55 6,94 1,082
Test Device 3: J23117.BCD2.E0040.B0015
(Colony 1)		 0,311 0,2984 0,2856 0,2999 429 429 420 441 0,26725 0,25465 0,24185 0,25615 203,25 203,25 194,25 215,25 0,12 0,13 0,13 0,13 0,13 0,01 0,13 1,042
Test Device 3: J23117.BCD2.E0040.B0015
(Colony 2)		 0,3246 0,2989 0,3006 0,2911 445 442 439 446 0,28085 0,25515 0,25685 0,24735 219,25 216,25 213,25 220,25 0,12 0,13 0,13 0,14 0,13 0,01 0,13 1,056
Test Device 4: J23101+I13504 (Colony 1) 0,1557 0,1439 0,1464 0,1738 4924 4659 4563 5092 0,11195 0,10015 0,10265 0,13005 4698,25 4433,25 4337,25 4866,25 6,65 7,02 6,70 5,93 6,58 0,46 6,56 1,074
Test Device 4: J23101+I13504 (Colony 2) 0,339 0,3188 0,3064 0,3239 2372 2357 2297 2523 0,29525 0,27505 0,26265 0,28015 2146,25 2131,25 2071,25 2297,25 1,15 1,23 1,25 1,30 1,23 0,06 1,23 1,052
Test Device 5: J23106+I13504 (Colony 1) 0,1581 0,1471 0,1531 0,1763 5031 4916 4830 5472 0,11435 0,10335 0,10935 0,13255 4805,25 4690,25 4604,25 5246,25 6,66 7,20 6,68 6,28 6,70 0,38 6,69 1,058
Test Device 5: J23106+I13504 (Colony 2) 0,3438 0,3134 0,3063 0,336 2368 2321 2299 2513 0,30005 0,26965 0,26255 0,29225 2142,25 2095,25 2073,25 2287,25 1,13 1,23 1,25 1,24 1,21 0,06 1,21 1,048
Test Device 6: J23117+I13504 (Colony 1) 0,3271 0,3082 0,3093 0,2938 328 322 335 341 0,28335 0,26445 0,26555 0,25005 102,25 96,25 109,25 115,25 0,06 0,06 0,07 0,07 0,06 0,01 0,06 1,123
Test Device 6: J23117+I13504 (Colony 2) 0,3446 0,3161 0,3094 0,3191 332 329 336 330 0,30085 0,27235 0,26565 0,27535 106,25 103,25 110,25 104,25 0,06 0,06 0,07 0,06 0,06 0,00 0,06 1,068

2. Discussion

The protocol was easy to follow and the constructs were nicely expressed which allowed reliable and comparable measurements. In the process of obtaining transformed DH5α cells we did not encounter any problems with transformation as bacteria showed exceptional growth. The specific ratiometric conversion factor of our plate reader could be determined without further adjustments using the LUDOX-HS40 solution. When measuring the Fluorescein standard curve on a logarithmic scale the data points showed a linear distribution. The final step, the measurement of the fluorescence emission and optical density of the cells, resulted in the raw data shown in table 1.5. To make this data visually accessible the mean values for OD and fluorescence were calculated and plotted against their respective time points which are seen in the following graphs.
Figure 1.3:
Calculated means from both replicates for the OD600 after each time point
Figure 1.4:
Calculated means from both replicates for the fluorescence after each time point
Conclusively, these data suggest that the Interlab study was successful and that the provided protocol can be shared in the community for standardized fluorescence measurement with a plate reader.