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我们根据背景中介绍的苯酚类物质的污染现状设计了一个能够降解苯酚的回路。此回路由感应器与效应器组成。感应器部分的功能是感应苯酚的存在并且能够在有苯酚的情况下启动下游基因的表达，原本是有两种感受器备选，即DmpR和XylR，由于XylR对于氯酚类物质能不能响应无报道，而DmpR有报道能酚类物质，并且有文献报道对其进行改造能显著提高灵敏度以及响应的广谱性，所以选择了突变型的DmpR作为感应器。效应器主要的功能是对苯酚类物质进行降解原本有三种能降解苯酚的酶，即（1）苯酚羟化酶和儿茶酚双加氧酶连用（2）漆酶（3）酪氨酸酶。考虑到漆酶的最适温度不适合实验用的菌，并且效率低，排除漆酶。酪氨酸酶对于培养基以及菌内的酪氨酸有降解作用，会影响细菌状态，所以也排除。双酶连用有报道可以提高降解效率并且有底物广泛特异性的特点，所以选择其作为降解苯酚的酶。又考虑到生物安全性问题，为了防止菌在环境中的不受控制的生长以及质粒逃逸，我们在这个回路上增加了TA系统，达到了没有苯酚的情况下细菌的生长受到抑制，有苯酚情况下细菌扩增并且降解苯酚的效果。由于治理环境污染的细菌一般选择枯草芽孢杆菌，而所用到的酶，启动子都是在大肠杆菌中表达和验证的，所以我们计划用枯草芽孢杆菌和大肠杆菌两种菌搭载我们的回路，以下所介绍的设计都是存在枯草和大肠两套设计。

TA系统是由原核生物质粒以及染色体上操纵子编码的，TA操纵子由毒素（toxin）和抗毒素（anti-toxin）组成，抗毒素的半衰期小于毒素的半衰期。正常状态下，抗毒素和毒素形成复合体从而毒素无法发挥它的作用。当细菌遇到不适合其生长分裂的逆环境时，抗毒素和毒素的平衡被打破，毒素释放从而发挥很多的生物学功能，例如抑制蛋白质的合成，DNA复制，细胞壁的形成等。很多毒素是核酸酶，它可以位点特异性或者非特异性的切割mRNA。其他类型的毒素还有DNA旋转酶（一种拓扑异构酶）的抑制剂，激酶等。TA系统最早是在大肠杆菌的F质粒中被发现的，没有获得这个质粒的子代细菌会因为毒素从抗毒素中释放出来而死亡。这种现象叫做前分离细胞死亡（post-segregational cell killing，PSK）

TA系统是一种抗逆机制，用在例如营养缺乏，抗生素治疗，噬菌体感染，免疫系统攻击，缺氧和高温的应激反应中。这种情况下毒素会造成细菌的生长减缓和细胞周期的减慢甚至停滞。

TA系统一共有TypeⅠ-Ⅵ六种，毒素抗毒素的作用机理各不相同，本次实验中我们选取的是TypeⅣ的TA系统（Fig.2-1）中的cbtA和cbeA，毒素可以通过抑制细菌的结构蛋白合成来抑制细菌生长，抗毒素通过竞争同一靶标来中和毒素。

Fig.2-1：Type Ⅳ TA系统原理：毒素，抗毒素蛋白不直接结合，而是两者竞争性地作用于同一靶标

有文献报道,毒素发挥作用一段时间之内若抗毒素表达，细菌能够恢复正常生长因此，我们希望通过这一性质来控制菌体的诱导性生长。即实现在无诱导时，毒素表达，抑制结构蛋白合成，细菌停止分裂生长，若无诱导物加入则在一段时间后死亡，若期间加入诱导物，抗毒素表达，细菌恢复正常状态。

因为我们选择的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌两套系统，并且文献中没有报告枯草芽孢杆菌作用位点，所以我们对毒素作用位点进行BLAST，Fig.2-2 Fig.2-3是对其结构蛋白BLAST的结果

Fig.2-2:BLAST的两段序列分别为：cell wall structural complex MreBCD, actin-like component MreB（大肠杆菌）
rod shape-determining protein MreB （枯草芽孢杆菌）

Fig.2-3:BLAST的两段序列为GTP-binding tubulin-like cell division protein（大肠杆菌）
cell division protein FtsZ （枯草芽孢杆菌）

Reference：

1. Qian Tan，Naoki Awano,Masayori Inouye（2010）YeeV is an Escherichia coli toxin that inhibits cell division by targeting the cytoskeleton proteins, FtsZ and MreB，Molecular Microbiology (2011) 79(1), 109–118

2. Nathalie Goeders ， Laurence Van Melderen*（2014）Toxin-Antitoxin Systems as Multilevel Interaction SystemsToxins (Basel). 2014 Jan; 6(1): 304–324.

3.Zhongling Wen,1,2,† Pengxia Wang,1,† Chenglong Sun,1,2 Yunxue Guo,1 and Xiaoxue Wang1,*（2017）Interaction of Type IV Toxin/Antitoxin Systems in Cryptic Prophages ofEscherichia coli K-12，Toxins (Basel). 2017 Mar; 9(3): 77.

4. Laboratoire de Génétique et Physiologie Bactérienne, IBMM, Faculté des Sciences, Université Libre de Bruxelles (ULB), 12 rue des Professeurs Jeener et Brachet, Gosselies B-6041, Belgium（2014）Toxin-Antitoxin Systems as Multilevel Interaction SystemsToxins 2014, 6(1), 304-324

5. YeeU enhances the bundling of cytoskeletal polymers of Hisako Masuda,Qian Tan,Naoki Awano,Kuen-Phon Wu,Masayori Inouye （2012） MreB and FtsZ, antagonizing the CbtA (YeeV) toxicity inEscherichia coliMolecular Microbiology (2012) 84(5), 979–989

DmpR是一种能对苯酚响应的启动子，它由两部分构成（Fig2-4），组成型表达的DmpR作为结合酚类结合蛋白结合扩散进细胞的酚类，复合物结合P0启动子诱导下游基因的表达

Fig2-4：DmpR启动子的构成

文献显示,野生型的DmpR响应的底物范围有限（Fig.2-5）2013年北大的项目把DmpR做了突变，拓宽了其能响应的底物范围，但是依旧不能响应二氯苯酚。

Fig2-5野生型的DmpR对不同底物的响应

经过查阅文献，找到了一种能响应苯酚，一氯酚，二氯酚的DmpR突变型B23（Fig.2-6），其在Sensor Domin较野生型突变了2个AA（Fig2-7）。因此我们想把它用作感应苯酚并且诱导下游基因表达的感受器。

Fig.2-6:(A)三种DmpR突变型对酚类及氯代芳酚混合物的响应强度(B)三种突变型对氯酚类的响应强度(100μM，26℃)

Fig.2-7：不同突变型DmpR的蛋白序列比对

而且野生型相比，突变型对苯酚氯酚等物质的响应更加灵敏。Fig.2-8表明了各种突变型对苯酚与氯酚的响应强度更高以及突变型B24对苯酚、氯酚的响应浓度更加灵敏

Fig.2-8：(A)对25μM各种氯酚的响应强度（B）B24突变型对氯酚、苯酚的响应浓度

据文献报道，DmpR的组成型表达的启动子与RBS以及终止子都对其灵敏度有影响。因此我们对本启动子进行改造，用了文献中已有报道的promoter以及T7 RBS，旨在达到最高的灵敏度。我们在大肠杆菌中构建了野生型、j23114、T7三种promoter。根据2012年LMU_Munich的工作，我们选择出枯草芽孢杆菌中强中弱三中强度的promoter，并通过实验筛选出最佳的sensor。

Reference：

1. 枯草芽孢杆菌所对应的所有启动子：2012 iGEM LMU_Munich

2. 大肠杆菌Pr启动子：2013 iGEM Peking

3. 大肠杆菌P0启动子：2013 iGEM Peking

4. 大肠杆菌BBa_J23114启动子：文献Su-Lim Choi. Toward a Generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits[J].ACS,2013,().

5. Sensing of Aromatic Compounds by the DmpR Transcriptional Activator of Phenol-Catabolizing Pseudomonas sp. Strain CF600

6. Generation of Novel Bacterial Regulatory Proteins That Detect Priority Pollutant Phenols ARLENE A. WISE AND CHERYL R. KUSKE

7. Monitoring Phenolic Compounds During Biological Treatment of Kraft Pulp Mill Effluent Using Bacterial BiosensorsV. L. Campos,1 J. Veas,2 C. A. Zaror,2 M. A. Mondaca1

8. Detection of Chlorinated Phenols in Kraft Pulp Bleaching Effluents Using DmpR Mutant StrainsV. L. Campos,1 C. A. Zaror,2 M. A. Mondaca1

自然状态下，苯酚的降解一般分为两步，即单加氧酶催化加羟基，而后双加氧酶催化开环（Fig2-9），我们选择了两个单加氧酶、两个双加氧酶。

Fig2-9：苯酚降解途径，1→2为单加氧酶催化，C12O与C23O为两种不同双加氧酶催化开环途径

（一）单加氧酶：TfdB-JLU（主选）DW-1备选

TfdB-JLU是一种2，4二氯二苯酚羟化酶，该蛋白质理论分子量为 64 KDa，等电点为 6.27，属于一种弱酸性的蛋白。它可以在有氧与NADPH的情况下把苯酚类物质转变为邻苯二酚（Fig2-10）。有文献报道，此酶的底物具有广泛特异性，除2，4二氯苯酚以外，苯酚类物质，多环芳香烃类物质也能很好的转化。

Fig2-10：TfdB-JLU催化反应方程式

此酶是在大肠杆菌中表达的，没有出现降解酪氨酸而使大肠杆菌生长不佳的状况出现，因此初步认定该酶不会对酪氨酸进行降解。同时为了避免非法位点，我们根据文献支持依据密码子偏好性做了单碱基同义突变。

首先，我们确认了该酶在苯酚、氯酚存在的条件下能够一定较高的活性（如下表所示）

此外，该酶对苯酚氯酚的降解效率、酶的反应条件PH、温度等也已有报道（如下表所示），而且可以认为其降解效率有使用价值。

酶浓度与酶活关系

DW-1是对于降解苯酚细菌的筛选后基因组定位得到的苯酚羟化酶，此酶在菌中的效果较好（Fig2-11)，但是没有报道提纯此酶并且鉴定酶学性质。

Fig2-12：DW-1降解效率

（二）双加氧酶：chpA-1，CaO19_12036

chpA-1的酶学性质

绝对速率

酶稳定性

CaO19_12036

底物及Kcat值如下

PH及温度不同时，活性如下

Reference：

[1]Yang Lu • Ying Yu Cloning and characterisation of a novel 2,4-dichlorophenol hydroxylase from a metagenomic library derived from polychlorinated biphenyl-contaminated soil

[2]2_4_二氯苯酚羟化酶对芳香族化合物的非专一性研究_战阳

[3]Community Analysis and Recovery of Phenol-degrading Bacteria from Drinking Water Biofilters Qihui Gu1,2, Qingping Wu2 *, Jumei Zhang2 , Weipeng Guo2 , Huiqin

[4]枯草芽孢杆菌同义密码子使用偏性对蛋白质折叠速率的影响_于志芬

[5]Tsai S C, Li Y K. Purification and characterization of a catechol 1, 2-dioxygenase from a phenol degrading Candida albicans TL3[J]. Archives of microbiology, 2007, 187(3): 199-206.

[6]Broderick J B, O'Halloran T V. Overproduction, purification, and characterization of chlorocatechol dioxygenase, a non-heme iron dioxygenase with broad substrate tolerance[J]. Biochemistry, 1991, 30(29): 7349-7358.

[7]An H R, Park H J, Kim E S. Cloning and expression of thermophilic catechol 1, 2-dioxygenase gene (catA) from Streptomyces setonii[J]. FEMS microbiology letters, 2001, 195(1): 17-22.

其中，Pc是组成型表达启动子，经我们筛选得出，P0是诱导型表达启动子，没有苯酚的情况下，只有DmpR蛋白和毒素蛋白表达，细菌处在受抑制的状态，当苯酚出现时，苯酚与DmpR结合，形成复合物，启动P0下游抗毒素与酶的表达，抗毒素与毒素中和让细菌重新生长繁衍，酶降解苯酚。以下是两种处理方案

1.单菌+双酶

即酶的部分为单加氧酶和苯酚羟化酶同时存在于一个细菌内。细菌同时表达单加氧酶和双加氧酶，苯酚的降解可以在一个细菌内完成。

2.双菌+双酶

即单加氧酶和双加氧酶分别转入两个不同细菌中，一个细菌只表达一种酶。苯酚的降解需要先通过第一个细菌的单加氧酶作用转变为邻苯二酚，产物扩散出细菌，进入第二个细菌中被双加氧酶开环降解。