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Notebook

Document the dates you worked on your project. This should be a detailed account of the work done each day for your project.

What should this page have?

Chronological notes of what your team is doing.
Brief descriptions of daily important events.
Pictures of your progress.
Mention who participated in what task.

Inspiration

You can see what others teams have done to organize their notes:

Tuesday, June 6th

Cleaned up the lab. Picked up and installed lab equipment. Culture of E.Coli strains TG1 and DH5α. Made starters from cryotubes (swabbed with a toothpick and put in erlenmeyer with LB medium). Incubated at 37°C.

Wednesday, June 7th

Culture des souches

Récupération des souches mises en culture la veille : DH5α et TG1

Pour vérifier les concentrations, on mesure la DO. Pour cela on doit diluer la culture car la mesure optimale de l’appareil est entre 0,1 et 0,8. On dilue donc au 1/10 les cultures dans la cuve avec de l’eau distillé. On mesure donc TG1 : 5,16 / DH5α : 5,21

Pour calculer le volume à prélever pour nos 100 mL on fait :

$$DO VoulueDO Obtenue avant dilutionVolume = 0,15,16 100 \simeq 2 mL$$

E.Coli étant aérobie, on va stocker la solution dans le LB dans un erlenmeyer de 5x le volume, donc 500mL et mettre à incuber 1h.

Glycérolisation des souches

Le fait de mettre les souches dans le glycérol va les protéger du froid, nécessaire quand on va congeler à -80°C pour pas que les cellules ne meurent.

40% Glycérol dans les cryotubes de 1,8mL → 0,9 de glycérol et 0,9 de souches.

On va congeler les cellules en phases exponentielles afin de rendre nos cellules compétentes, c’est à dire capable d’incorporer de l’ADN.

Bactérie compétente

Pour faire des bactéries compétentes, il faut les prendre en phase exponentiel de croissance. On prélève donc une quantité de bactérie que l’on à mis dans du milieu LB puis incubé 1h à 37°C.

On veut une DO à 0,1 dans 100 mL.

Pour TG1-> 1,94 mL

Pour DH5α-> 1,92 mL

Prise des DO au bout d’une heure :

TG1 - 0,4

DH5α - 0,3

Prise des DO au bout d’1h40 : TG1 - 0,7 DH5α - 0,5

Préparation des tampons : Solution TBF1 et TBF2

Préparation des solutions préalables aux tampons :

KAc	50 mL → 4,9 g
MnCl2	200 mL → 19,79 g
KCl	200 mL → 14,91 g
MOPS	50 mL → 2,09 g

Fabrication des deux solutions nécessaires à la fabrication de cellules compétentes.

Buffer 1 - 80 mL :

2,4 mL KAc [1 M], 8 mL MnCl2 [0,5 M], 8 mL KCl [1M] , 8 mL CaCl2 [0,1 M], 15 mL Gly [80%], → 38,6 mL H2O

Buffer 2 - 8 mL :

400 µL MOPS [0,2M], 6 mL CaCl2 [0,1 M], 1,5 mL Gly [80%],80µL KCl [1 M], 500 µLH2O

Chaque solution est passée à l’autoclave.

Centrifugation 10min à 4500 rpm à 4°C. Le culot doit ensuite être resuspendu dans 80 mL de Tbf1 (20 ml)

Team:Aix-Marseille/Notebook