Difference between revisions of "Team:HUST-China/Experiments"

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                     <h4><strong>①Amplify</strong> </h4>
 
                     <h4><strong>①Amplify</strong> </h4>
 
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                         <I><I><I><I><I><I><I>pmrA-B-Fe</I></I></I></I></I></I></I>、 <I>  <I>  <I>  <I> pmrC-GFP </I></I></I></I>  gene through the pcr protocol
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                         <I><I><I><I><I><I><I>PmrA-B-Fe</I></I></I></I></I></I></I>、 <I>  <I>  <I>  <I> PmrC-GFP </I></I></I></I>  gene through the pcr protocol
 
                     </p>
 
                     </p>
 
                     <h4><strong>②Plasmid Construction</strong> </h4>
 
                     <h4><strong>②Plasmid Construction</strong> </h4>
 
                     <p>
 
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                       Coding sequences  <I> pmrA-pmrB</I> and  <I>  <I>  <I>  <I> pmrC-GFP </I></I></I></I>were cloned into the expression vector pBAD30 by restriction enzyme digestion and DNA ligation.
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                       Coding sequences  <I> PmrA-PmrB</I> and  <I>  <I>  <I>  <I> PmrC-GFP </I></I></I></I>were cloned into the expression vector pBAD30 by restriction enzyme digestion and DNA ligation.
 
                     </p>
 
                     </p>
 
                     <div class="experiment_circuit col-md-4 col-xs-4 col-md-offset-4 col-xs-offset-4">
 
                     <div class="experiment_circuit col-md-4 col-xs-4 col-md-offset-4 col-xs-offset-4">
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                         <h4><strong>③Detection</strong> </h4>
 
                         <h4><strong>③Detection</strong> </h4>
 
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                         <p>
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                           Arabinose was used to induce expression of pmrABC system.
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                           Arabinose was used to induce expression of PmrABC system.
 
                         </p>
 
                         </p>
 
                         <p>
 
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                           We use the original <I>  <I>  pmrA-pmrB-Fe </I> </I>-<I>  <I>  <I>  <I> pmrC-GFP </I></I></I></I>circuit to test whether our  
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                           We use the original <I>  <I>  PmrA-PmrB-Fe </I> </I>-<I>  <I>  <I>  <I> PmrC-GFP </I></I></I></I>circuit to test whether our  
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                           pmrABC system works in our plasmid, then the expression and efficacy  
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                           PmrABC system works in our plasmid, then the expression and efficacy  
 
                           of LBT1-12 were tested .
 
                           of LBT1-12 were tested .
 
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                         </p>
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                           <tbody>
 
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                                   <tr>
 
                                   <tr>
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                                     <td>pmrA-pmrB/Fe- <I> pmrC-GFP </I></td>
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                                     <td>PmrA-PmrB/Fe- <I> PmrC-GFP </I></td>
 
                                     <td>pBAD30</td>
 
                                     <td>pBAD30</td>
−
                                     <td>Test whether our pmrABC system works in our plasmid</td>
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                                     <td>Test whether our PmrABC system works in our plasmid</td>
 
                                   </tr>
 
                                   </tr>
 
                                   <tr>
 
                                   <tr>
−
                                     <td>pmrA-pmrB/LBT1- <I>  <I>  <I>  <I> pmrC-GFP </I></I></I></I></td>
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                                     <td>PmrA-PmrB/LBT1- <I>  <I>  <I>  <I> PmrC-GFP </I></I></I></I></td>
 
                                     <td>pBAD30</td>
 
                                     <td>pBAD30</td>
 
                                     <td> Detecting effectiveness of protein LBT1</td>
 
                                     <td> Detecting effectiveness of protein LBT1</td>
 
                                   </tr>
 
                                   </tr>
 
                                   <tr>
 
                                   <tr>
−
                                     <td>pmrA-pmrB/LBT2- <I> pmrC-GFP </I></td>
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                                     <td>PmrA-PmrB/LBT2- <I> PmrC-GFP </I></td>
 
                                     <td>pBAD30 </td>
 
                                     <td>pBAD30 </td>
 
                                     <td> Detecting effectiveness of protein LBT2</td>
 
                                     <td> Detecting effectiveness of protein LBT2</td>
 
                                   </tr>
 
                                   </tr>
 
                                   <tr>
 
                                   <tr>
−
                                     <td>pmrA-pmrB/LBT3- <I> pmrC-GFP </I></td>
+
                                     <td>PmrA-PmrB/LBT3- <I> PmrC-GFP </I></td>
 
                                     <td>pBAD30 </td>
 
                                     <td>pBAD30 </td>
 
                                     <td>Detecting effectiveness of protein LBT3</td>
 
                                     <td>Detecting effectiveness of protein LBT3</td>
 
                                   </tr>
 
                                   </tr>
 
                                   <tr>
 
                                   <tr>
−
                                     <td>pmrA-pmrB/LBT4- <I> pmrC-GFP </I></td>
+
                                     <td>PmrA-PmrB/LBT4- <I> PmrC-GFP </I></td>
 
                                     <td> pBAD30 </td>
 
                                     <td> pBAD30 </td>
 
                                     <td>Detecting effectiveness of protein LBT4</td>
 
                                     <td>Detecting effectiveness of protein LBT4</td>
 
                                   </tr>
 
                                   </tr>
 
                                   <tr>
 
                                   <tr>
−
                                     <td>pmrA-pmrB/LBT5- <I> pmrC-GFP </I></td>
+
                                     <td>PmrA-PmrB/LBT5- <I> PmrC-GFP </I></td>
 
                                     <td>pBAD30</td>
 
                                     <td>pBAD30</td>
 
                                     <td>Detecting effectiveness of protein LBT5</td>
 
                                     <td>Detecting effectiveness of protein LBT5</td>
 
                                   </tr>
 
                                   </tr>
 
                                   <tr>
 
                                   <tr>
−
                                     <td>pmrA-pmrB/LBT6- <I>  <I>  <I>  <I> pmrC-GFP </I></I></I></I></td>
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                                     <td>PmrA-PmrB/LBT6- <I>  <I>  <I>  <I> PmrC-GFP </I></I></I></I></td>
 
                                     <td>pBAD30</td>
 
                                     <td>pBAD30</td>
 
                                     <td> Detecting effectiveness of protein LBT6</td>
 
                                     <td> Detecting effectiveness of protein LBT6</td>
 
                                   </tr>
 
                                   </tr>
 
                                   <tr>
 
                                   <tr>
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                                     <td>pmrA-pmrB/LBT7- <I> pmrC-GFP </I></td>
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                                     <td>PmrA-PmrB/LBT7- <I> PmrC-GFP </I></td>
 
                                     <td>pBAD30 </td>
 
                                     <td>pBAD30 </td>
 
                                     <td> Detecting effectiveness of protein LBT7</td>
 
                                     <td> Detecting effectiveness of protein LBT7</td>
 
                                   </tr>
 
                                   </tr>
 
                                   <tr>
 
                                   <tr>
−
                                     <td>pmrA-pmrB/LBT8- <I> pmrC-GFP </I></td>
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                                     <td>PmrA-PmrB/LBT8- <I> PmrC-GFP </I></td>
 
                                     <td>pBAD30 </td>
 
                                     <td>pBAD30 </td>
 
                                     <td>Detecting effectiveness of protein LBT8</td>
 
                                     <td>Detecting effectiveness of protein LBT8</td>
 
                                   </tr>
 
                                   </tr>
 
                                   <tr>
 
                                   <tr>
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                                     <td>pmrA-pmrB/LBT9- <I> pmrC-GFP </I></td>
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                                     <td>PmrA-PmrB/LBT9- <I> PmrC-GFP </I></td>
 
                                     <td> pBAD30 </td>
 
                                     <td> pBAD30 </td>
 
                                     <td>Detecting effectiveness of protein LBT9</td>
 
                                     <td>Detecting effectiveness of protein LBT9</td>
 
                                   </tr>
 
                                   </tr>
 
                                   <tr>
 
                                   <tr>
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                                     <td>pmrA-pmrB/LBT10- <I> pmrC-GFP </I></td>
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                                     <td>PmrA-PmrB/LBT10- <I> PmrC-GFP </I></td>
 
                                     <td>pBAD30 </td>
 
                                     <td>pBAD30 </td>
 
                                     <td> Detecting effectiveness of protein LBT10</td>
 
                                     <td> Detecting effectiveness of protein LBT10</td>
 
                                   </tr>
 
                                   </tr>
 
                                   <tr>
 
                                   <tr>
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                                     <td>pmrA-pmrB/LBT11- <I> pmrC-GFP </I></td>
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                                     <td>PmrA-PmrB/LBT11- <I> PmrC-GFP </I></td>
 
                                     <td>pBAD30 </td>
 
                                     <td>pBAD30 </td>
 
                                     <td>Detecting effectiveness of protein LBT11</td>
 
                                     <td>Detecting effectiveness of protein LBT11</td>
 
                                   </tr>
 
                                   </tr>
 
                                   <tr>
 
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                                     <td>pmrA-pmrB/LBT12- <I>  <I>  <I>  <I> pmrC-GFP </I></I></I></I></td>
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                                     <td>PmrA-PmrB/LBT12- <I>  <I>  <I>  <I> PmrC-GFP </I></I></I></I></td>
 
                                     <td> pBAD30 </td>
 
                                     <td> pBAD30 </td>
 
                                     <td>Detecting effectiveness of protein LBT12</td>
 
                                     <td>Detecting effectiveness of protein LBT12</td>
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                     <h3 style="background-color:#ce6b9a;color:#ffffff; padding:10px;letter-spacing:1px; margin-top:0;">Construction of the whole circuit</h3>
 
                     <h3 style="background-color:#ce6b9a;color:#ffffff; padding:10px;letter-spacing:1px; margin-top:0;">Construction of the whole circuit</h3>
 
                     <p>
 
                     <p>
−
                     <I> pmrA-pmrB-Fe-pmrC-GFP</I>  All of our part should be built in one plasmid. Therefore, we use endonuclease and ligase to  replace the GFP by Oprf-LBT and Oprf-Si tag.
+
                     <I> PmrA-PmrB-Fe-PmrC-GFP</I>  All of our part should be built in one plasmid. Therefore, we use endonuclease and ligase to  replace the GFP by Oprf-LBT and Oprf-Si tag.
 
                     </p>
 
                     </p>
 
                     <img title="demo1" src="https://static.igem.org/mediawiki/2017/5/58/2017_HUST_China_Experiment_image4.png" alt="experiment_circuit" alt="demo1" class="col-xs-4 col-xs-offset-4" style="padding: 10px 0px;">  
 
                     <img title="demo1" src="https://static.igem.org/mediawiki/2017/5/58/2017_HUST_China_Experiment_image4.png" alt="experiment_circuit" alt="demo1" class="col-xs-4 col-xs-offset-4" style="padding: 10px 0px;">  
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                 <div id="section4" style="border: solid 1px #666; margin:5px;border-radius:10px;overflow: hidden;">     
 
                 <div id="section4" style="border: solid 1px #666; margin:5px;border-radius:10px;overflow: hidden;">     
 
                     <h3 style="background-color:#ce6b9a;color:#ffffff; padding:10px;letter-spacing:1px;margin-top:0;">Detection of sensing part </h3>
 
                     <h3 style="background-color:#ce6b9a;color:#ffffff; padding:10px;letter-spacing:1px;margin-top:0;">Detection of sensing part </h3>
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                     <p>We use our medium containing a small amount of rare earth ions to culture our E. coli. When our engineered E. coli sense the existence of rare earth ions, the pmrC promoter will activate the transcription of the GFP gene. Through the detection of GFP expression, we can know the efficacy of the sensing part. </p>
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                     <p>We use our medium containing a small amount of rare earth ions to culture our E. coli. When our engineered E. coli sense the existence of rare earth ions, the PmrC promoter will activate the transcription of the GFP gene. Through the detection of GFP expression, we can know the efficacy of the sensing part. </p>
 
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Revision as of 15:45, 31 October 2017

Experiment

「Experiment」

Sensing part

The sensing part is to achieve the awareness of the engineering bacteria on the rare earth ions in the environment.

①Amplify

PmrA-B-Fe、 PmrC-GFP gene through the pcr protocol

②Plasmid Construction

Coding sequences PmrA-PmrB and PmrC-GFP were cloned into the expression vector pBAD30 by restriction enzyme digestion and DNA ligation.

experiment_circuit

Then we transformed these vectors into Ecoli BL21 cells.

③Detection

Arabinose was used to induce expression of PmrABC system.

We use the original PmrA-PmrB-Fe - PmrC-GFP circuit to test whether our PmrABC system works in our plasmid, then the expression and efficacy of LBT1-12 were tested .

gene circuit vector description
PmrA-PmrB/Fe- PmrC-GFP pBAD30 Test whether our PmrABC system works in our plasmid
PmrA-PmrB/LBT1- PmrC-GFP pBAD30 Detecting effectiveness of protein LBT1
PmrA-PmrB/LBT2- PmrC-GFP pBAD30 Detecting effectiveness of protein LBT2
PmrA-PmrB/LBT3- PmrC-GFP pBAD30 Detecting effectiveness of protein LBT3
PmrA-PmrB/LBT4- PmrC-GFP pBAD30 Detecting effectiveness of protein LBT4
PmrA-PmrB/LBT5- PmrC-GFP pBAD30 Detecting effectiveness of protein LBT5
PmrA-PmrB/LBT6- PmrC-GFP pBAD30 Detecting effectiveness of protein LBT6
PmrA-PmrB/LBT7- PmrC-GFP pBAD30 Detecting effectiveness of protein LBT7
PmrA-PmrB/LBT8- PmrC-GFP pBAD30 Detecting effectiveness of protein LBT8
PmrA-PmrB/LBT9- PmrC-GFP pBAD30 Detecting effectiveness of protein LBT9
PmrA-PmrB/LBT10- PmrC-GFP pBAD30 Detecting effectiveness of protein LBT10
PmrA-PmrB/LBT11- PmrC-GFP pBAD30 Detecting effectiveness of protein LBT11
PmrA-PmrB/LBT12- PmrC-GFP pBAD30 Detecting effectiveness of protein LBT12

Recycling part

The recycling part is to capture the rare earth ions in the environment and to anchor our cells over the silicon net.

①With appropriate primers, PCR was carried out to amplify target gene oprf-LBT1-12 and oprf-Si tag.

②Then we constructed two vectors to achieve expression of LBT and Si-tag.

demo1 experiment_circuit

We cloned the sequence of oprf-LBT and Si-tag into the vector pET28α in order to make the sequence be tagged N-terminally with a 6×His tag. 6×His tag is an affinity tag which allows the tagged recombinant protein to be purified in the process of affinity purification.

③Detection

In the meanwhile,we added the FLAG tag to achieve that whether the LBTs and the Si tag was expressed on the cell membrane.

Construction of the whole circuit

PmrA-PmrB-Fe-PmrC-GFP All of our part should be built in one plasmid. Therefore, we use endonuclease and ligase to replace the GFP by Oprf-LBT and Oprf-Si tag.

experiment_circuit

Detection of sensing part

We use our medium containing a small amount of rare earth ions to culture our E. coli. When our engineered E. coli sense the existence of rare earth ions, the PmrC promoter will activate the transcription of the GFP gene. Through the detection of GFP expression, we can know the efficacy of the sensing part.

Detection of adsorption capacity of LBTs

A method of precipitation titration is used to detect the level of rare earth ions adsorption. We add a certain concentration of bacteria to the solution containing different concentrations of rare earth ions. Then centrifuge to remove the bacteria in the solution.

experiment_circuit

In order to make the terbium ions sufficiently precipitated, we add excess base. Rinse the precipitate and dissolve the precipitate with hydrochloric acid titration. In this way, we can know the amount of terbium ions which have already adsorbed on the surface of the bacteria.

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