Team:PASantiago Chile/project
Este proyecto consiste en que modificaremos la bacteria Escherichia coli, a través de la
Biología Sintética, que se basa en la creación o modificación de organismos ya existentes,
logrando que tengan las características que deseamos. Este organismo sensará los altos niveles de
partículas alfa, beta, rayos gamma y rayos X emitidos, factores que provocan una mutación en el
ADN de dicha bacteria que dará una coloración morada y el aroma a limón.
Para validar que la investigación es necesaria y apoyada por los especialistas del área, se realizó
una encuesta a estudiantes de radiología, tecnólogos médicos y trabajadores de centros
radiológicos, obteniendo un 83% de aprobación, sobre la necesidad de mejores dosímetros que
sean de resultado confiable.
Para esto a través de una investigación científica, se diseñó un sensor que se basa en un switch
bifásico, dispositivo que puede ser apagado o encendido de acuerdo a la concentración del imput.
Dicho switch regula naturalmente fago lambda, que en este caso al activarse el Promotor pRM da
paso a la transcripción del represor Cl, que a su vez provocará la inhibición del promotor Pr y no
se podrán transcribir Cro, LuxR y LuxI. En cambio, si se detecta el daño del ADN, con ayuda de
la proteína RecA, se separa el represor Cl y deja de activarse el promotor pRM, dando paso a la
activación de pR (promotor) y a la transcripción de Cro, LuxR y LuxI. (Plásmido 1)
Este circuito se basa en el virus bacteriófago (fago) lambda lisogénico, de ADN bicatenario que infecta a la E. Coli y fue descubierto en 1951 por Esther Lederberg. Sus extremos cohesivos del material genético, hace que tras la infección su genoma se haga circular, y si sigue con el ciclo lisogénico se comporta como un plásmido aprovechando las enzimas de la recombinación de la bacteria integrándose al genoma de esta.
En el ciclo lisogénico, el virus se inserta en un punto concreto del genoma de la bacteria y se replica cuando esta lo hace, pasando sus genes a las E. coli duplicadas. El virus sintetiza a partir del represor Cl, que inhibe la expresión del resto de los genes, donde en condiciones de estrés celular la bacteria activa la respuesta SOS, actuando RecA para inhibir la actividad del represor Cl que desemboca una respuesta en cascada que hace al virus integrado pasar a vía lítica. Es aquí donde habitualmente se infecta a célula, produciendo partículas virales que son liberadas al medio, una vez que la bacteria hospedadora es lisada (se rompe la membrana celular), matándola en el proceso.
Con la activación de RecA y la transcripción de los genes Cro, LuxR y LuxI, se dará paso a la activación del segundo plásmido con el promotor LuxR/HSL, el cual permitirá que se transcriban de igual manera la cromoproteína que dará el color morado, y el gen con olor a limón. Esto será la señal de alerta para nuestro especialista. (Plásmido 2)
El funcionamiento del circuito, tiene como inspiración el trabajo ya realizado por el grupo de IGEM 2011, Penn States, que, de igual manera detectan los índices dañinos de radiación, pero a diferencia del nuestro, RecA detecta el daño, evita la reparación y conecta a un reportero para saber dónde está el ADN dañado. (States, 2011)
RecA es una proteína multifuncional, que es esencial para diferentes procesos biológicos. La regulación coordinada de expresión de genes no vinculados en respuesta al ADN dañado, también conocida como respuesta SOS, es el que importa para este proyecto.
El rol regulador de RecA, trabaja con un operón SOS de aproximadamente 20 genes no vinculados inducibles por la sobreexposición a agentes que dañan el ADN. Las enzimas codificadas que inducen estos genes funcionan para cortar el ADN dañado y facilitar la reparación de los posibles daños que ocurren en la recombinación de ADN.
La expresión de los genes SOS es controlada por el represor LexA que reprime su respuesta, se une al grupo de los genes SOS inducibles y limita su transcripción. Después de que el evento con altos índices de radiación ha ocurrido, la actividad co-proteasa de RecA se activa, debido a la generación de un ADN de solo una hebra, ya sea por la acción de las nucleasas o porque la horquilla de replicación está estancada.
Descripción del Proyecto
El sensor y sus partes
¿Por qué nos sirve la proteína RecA?
Este ADN de solo una hebra (ssDNA) se une a RecA en presencia de ATP, promoviendo la formación de una nucleoproteína que separa el represor LexA e induce los genes SOS, incluyendo la misma RecA. Los genes que se unen débilmente a LexA, son los primeros que se expresan completamente. Si el daño persiste o es muy alto, la concentración de la proteína RecA aumenta, y otros operones se ven afectados al estar unidos a LexA.
Normalmente, RecA es reprimida a un nivel basal de 1000 moléculas por célula. Una vez que se separa el represor LexA, se ve incrementado rápidamente en 20 veces la cantidad de la proteína (10 moléculas por segundo), alcanzando su máximo en una hora desde que ocurrió el evento de daño. Las cantidades de la proteína RecA vuelven a sus niveles basales dentro de 4 a 6 horas, desde el suceso. Esta disminución, provoca la remoción de la señal inducida por la reparación del daño de ADN, eliminando el agente que activa la proteína RecA, resultando en la incrementación de la concentración del represor LexA. Se reestablece la represión del sistema SOS y la célula vuelve a su estado inicial. (Bianco & Kowalczykowski, 1998)
