Team:SJTU-BioX-Shanghai/Results-cn

结果

抑制泄漏

在我们的表征实验中，STAR可以有效抑制下游基因的表达。我们采用sfGFP（BBa_K515005）作为下游的报告基因，对应STAR1/3系统设计了Target有无的对照（见图1），监测其生长过程中荧光值和OD值的变化。

图1 抑制泄漏表征质粒的示意图 其中含Target1的表征质粒构建在pCDF duet-1质粒上，含Target3的表征质粒构建在pET duet-1质粒上。这两种表征系统都配以常启动子J23119，和同样的终止子。

如图1A、1B所显示，在培养的400min里，有Target1或Target3存在时sfGFP的表达明显地降低。而在两个STAR系统的比较中，可以看出由我队设计并改进的STAR3系统的target抑制效果更好，其荧光值只略高于空白对照，与无target情况下sfGFP的表达形成鲜明对照。在实验中我们有平行进行三次生物学重复，其结果一致显示Target3的抑制下过更强。图3C表现出在培养的第600min，不同实验组的标准荧光值差距。这里我们取荧光值/OD600来消除细菌生长对荧光值带来的影响。

图2 Target在大肠杆菌DH5α中的表征实验（A）有或无Target1的大肠杆菌标准荧光值随时间变化曲线（B）有或无Target3的大肠杆菌标准荧光值随时间变化曲线（C）培养结束点上无Target和有Target1、Target3的大肠杆菌的标准荧光值柱状图我们使用两种在设计部分介绍过的质粒来做STAR系统的表征。不含Target的实验组中转入的质粒不含Target序列而只存在常启动子J23119。标准化荧光值是用培养菌液的荧光值除以OD600。背景对照组是使用没有转入质粒的大肠杆菌DH5α。误差棒代表三次重复的标准差。

分子开关

当系统中只有T（target）存在时，下游基因的表达被关闭；A（antisense）和T（target）同时存在时，T的抑制作用被关闭，下游基因重新活跃表达。我们以sfGFP作为报告基因，验证了STAR系统的这种功能。

图3 STAR作为分子开关表征质粒示意图，其中含STAR 1的表达系统构建在pCDF duet-1质粒上，含STAR 3的表达系统构建在pET duet-1质粒上。每种STAR系统都是分别构建在一个质粒上的。

图4A/4B中的结果显示在500分钟的培养中，大肠杆菌有STAR系统--Target和Antisense同时存在的情况下sfGFP的表达明显升高。图3C/3D代表考虑到OD值的标准荧光值。这些图片里的数据显示，在培养的第600分钟有STAR系统的情况下，sfGFP表达量分别升高了超过两倍（对STAR1）和四倍（对STAR3）。这说明STAR 成功地对基因回路中基因表达起了抑制作用。

图4 STAR系统在大肠杆菌DH5α中的表征实验。（A）有无Antisense1表达的含STAR1系统的大肠杆菌标准荧光值随时间变化曲线。（B）有无Antisense3表达的含STAR3系统的大肠杆菌标准荧光值随时间变化曲线。（C）终点（第600min）STAR1系统有无Antisense1表达的标准荧光值柱状图。（D）终点（第600min）STAR3系统有无Antisense3表达的标准荧光值柱状图。我们使用在实验设计部分介绍过的单个质粒作为STAR系统表征实验的载体。没有STAR的实验组转入的质粒中不含STAR系统的序列。标准化荧光值是用菌液的荧光值除以OD600。背景对照组是使用没有转入质粒的大肠杆菌DH5α。误差棒代表三次重复的标准差。

STAR系统×色素蛋白

为了实现可视化和同时进行多因子检测的特点，我们选择色素蛋白作为下游的表达基因。并在众多色素蛋白中，特别选用颜色区别显著的三原色RGB（red、green、blue）进行实验。我们用到eforRed(BBa_K2285012)、amilGFP（BBa_K592010）、cjBlue（BBa_K592011）、amilCP（BBa_K1357009）等色素蛋白代表对应的三原色。

在实验中，我们将Target和色素蛋白相连接，分别构建出Target 1、Target 3和四种色素蛋白相连接的系统，并在双表达载体上（STAR1系统使用pCDF duet-1载体，STAR2系统使用pET duet-1载体）同时连有对应的Antisense 1和 Antisense 3。因此，此种基因回路可供未来的使用者在Antisense前插入其对应的响应元件，如操纵子、阻遏子等，以实现不同外界刺激引起色素蛋白表达量不同的结果，进而表现为肉眼可见的色素颜色深浅不同。

图5 在表达载体中我们用到的四种色素蛋白

图6 T+色素蛋白+A基因回路示意图其中在我们的项目中我们将上图两条基因回路串联在同一个表达载体里，因此转入一个质粒就可以实现对一个因子的报告，既减少宿主的负担，也为之后的多因子检测提供便捷。

	eforRed	amilGFP	amilCP	cjBlue
STAR1	In stock	In stock	In stock	In stock
STAR3	Not in stock	In stock	In stock	Not in stock

上表为我们目前已验证过的含有色素蛋白的STAR系统。我们已经提交对应的所有8种Target+色素蛋白在质粒pSB1C3上的标准化part，和对应的Antisense在pSB1C3上的标准化part。

由于人眼判断的局限性和误差，为了使我们的报告系统在可视化效果的基础上更加准确和可定量，并同时满足易操作和造价实惠的特性，我们设计了一款简易抽滤装置并配以可供手机拍照分析结果的app和为拍照分析提供稳定环境的盒子。详细信息请参考wiki的"检测"和"分析"页面。

图7 抽滤结果、盒子和app的首页界面 (A) 含eforRed的pET duet-1质粒导入E.coli，不同菌液浓度时使用简易装置抽滤在玻璃纤维滤纸上的效果图。 (B)为了手机拍照制作的可放置手机与目标滤纸的架子，已有成品，详见设备页面。

响应能力

为了验证我们所构建的STAR×色素蛋白报告系统的有效性和其响应能力，我们构建了lac操纵子介导和As金属启动子介导的两个系统。其中lac操纵子为我们所使用的质粒载体pCDF duet-1本身携带的，As启动子为iGEM2006_Edinburgh提供的part BBa_J33201。

图8 lac操纵子与As repressor调控STAR系统的基因回路示意图 As repressor和lac操纵子，都应插在Antisense之前，并且上图两个基因回路为target段在前，Antisense段在后相串联于同一个质粒载体中。

我们主要使用STAR 1系统进行对lac响应能力的表征，并且先用更易被定量监测到的sfGFP作为下游报告基因，以确定其准确程度。并在之后，使用eforRed作为报告基因，进行了色素蛋白层面的可视化表征。

图9 lac操纵子和As repressor对STAR的表征实验。A）含lac操纵子的STAR 1系统有无IPTG诱导情况下荧光随时间变化曲线图。图中实验质粒为pCDF duet-1，表征所用细胞为 BL21（DH3）E. coli。并且每次实验的对照组和实验组都为一个单菌落转接形成，且共进行过三次重复试验，以验证其有效性。B) eforRed作为下游报告基因的STAR 1系统在lac操纵下的颜色表征实验。C) As+STAR3系统酶切电泳图。图中所用marker为DL2000，第一泳道为使用As + antisense 3 两端对应的限制性内切酶NdeI和KpnI酶切构建的表达产物，而第二泳道为使用T3+sfGFP两端对应的限制性内切酶PstI和EcoRI酶切构建的表达产物。电泳槽缓冲液为0.5×TBE，胶含1%琼脂糖，使用染料DuRed，120v/100mA电泳20min。

从图中可以看出，含lac操纵子的STAR1系统对单一因素的表征实验中随时间变化，加IPTG和不加IPTG组的荧光值差异越来越明显，加IPTG诱导的实验组荧光值普遍高于不加IPTG的对照组，并且在加入IPTG诱导后10h，达到6倍的差距.说明我们的STAR1系统作为分子开关是十分有效的。由于时间的限制，我们未能完成STAR3系统的sfGFP及色素蛋白的表征，我们计划在接下来的时间里完成STAR3系统分子开关作用的表征。并且，从STAR系统的表征中看来，STAR3 对 sfGFP的抑制和解抑制效果相比于STAR1更强，我们有理由相信 STAR3系统有更加完美精确的响应能力。因此也是分子开关的实力候选者。

关于As repressor引导的表达调控，我们已构建出完整的在STAR3系统上响应的As repressor，在表征质粒的酶切电泳图谱中可以看出第一条切As+ Antisense 3片段的产物有长约600-700bp的条带，第二条切sfGFP+T3片段的产物有长约900bp的条带，均符合目的条带长度。事实上我们已经通过桑格测序确定表征质粒构建成功。但由于时间的限制，我们还没有来得及对其进行表征实验，我们队伍计划在之后进行对其的表征实验。

多因子检测

由于STAR系统具有很强的正交性，以及所选用的下游报告基因颜色的区别，我们可以建设多因子检测的报告系统。在多因子检测中，二重因子检测最为直接和易分辨，未来的iGEM队伍可以使用我们的报告系统加上其目的检测因子的对应响应原件，并可构建多重因子检测系统。

我们初步用含色素蛋白的质粒共转，来模拟在实际情况中由多因子响应产生的颜色变化。

图10 色素蛋白共转显色表征

我们设想用不同的金属启动子来代表可响应的多因子检测元件，在实验中我们选取As repressor和Co repressor作为Antisense的启动元件。具体表现为，在As3+和Co2+存在的情况下，对应的repressor被开启，引起antisense的表达，从而减弱Target的抑制作用，表现为色素蛋白表达，产生明显的颜色变化。同时在一定的金属离子浓度范围内，随着金属离子浓度升高，antisense的解抑制作用越强，表现为其色素蛋白的颜色越深。并且两STAR系统分别建立在不同的相容质粒骨架上--pCDF duet-1、pET duet-1，为将两表达载体转入同一宿主大肠杆菌中提供了便捷。

图11 STAR系统进行多因子检测的基因回路

图12 Co+STAR1、As+STAR3电泳图

我们已经成功地分别构造出含有Co promoter的STAR1 和As promoter的STAR3系统，酶切电泳结果条带符合结果，并且已经通过测序。但由于时间限制，我们还没有进行相应的表征实验。

参考文献

Chappell J, Takahashi MK, Lucks JB. 2015. Creating small transcription activating RNAs. Nat Chem Biol 11:214–220.
Meyer, S., Chappell, J., Sankar, S., Chew, R., and Lucks, J. B. (2016) Improving fold activation of small transcription activating RNAs (STARs) with rational RNA engineering strategies Biotechnol. Bioeng. 113, 216.