Difference between revisions of "Team"

Line 24: Line 24:
 
24/07/17
 
24/07/17
 
<html>
 
<html>
−
 
 
<h1> <b>Media Preparation (had to remake the Agar) </h1> </b>  
 
<h1> <b>Media Preparation (had to remake the Agar) </h1> </b>  
 
<li>8x(200ml dH2O + 8g LB Agar).</li>
 
<li>8x(200ml dH2O + 8g LB Agar).</li>
Line 68: Line 67:
 
<li>Aliquot 50 microL aliquots into 1.5mL sterile eppendorf tubes and store at -80 degrees C..</li>  </p>
 
<li>Aliquot 50 microL aliquots into 1.5mL sterile eppendorf tubes and store at -80 degrees C..</li>  </p>
 
<p>
 
<p>
 +
<p dir="ltr">
 +
    Table of measured OD (during step 2):
 +
</p>
 +
<div dir="ltr">
 +
    <table>
 +
        <colgroup>
 +
            <col width="*"/>
 +
            <col width="*"/>
 +
            <col width="*"/>
 +
        </colgroup>
 +
        <tbody>
 +
            <tr>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        Time (min)
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        OD600 batch 1
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        OD600 batch 2
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        0
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        0
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        0
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        15
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        0.043
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        0.047
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        30
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        0.031
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        0.012
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        45
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        0.065
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        0.005
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        60
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        0.108
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        /
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        75
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        0.150
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        /
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
            </tr>
 +
            <tr>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        90
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        0.422
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
                <td>
 +
                    <p dir="ltr">
 +
                        /
 +
                    </p>
 +
                </td>
 +
            </tr>
 +
        </tbody>
 +
    </table>
 +
</div>
 +
<p dir="ltr">
 +
    NB: Calibrate with LB before inoculation, not with water.
 +
</p>
 +
<br/>

Revision as of 17:23, 29 October 2017

Protocols 

 19/07/2017

Media Preparation:

LB agar Miller: 4 x 200 mL bottles

  1. Add 8 g of agar in scott bottle.
  2. Pour in 200 mL of distilled water.
  3. Gently shake.
  4. Autoclave at
  5. Store at room temperature.

LB broth Miller:

  • 2 x 25 g in 1 L.
  • 5 x 50 mL in conical flasks.
  • 50 x 10 ml in universal flasks.

    • 24/07/17

    Media Preparation (had to remake the Agar)

  • 8x(200ml dH2O + 8g LB Agar).

      • 25/07/17

      Cultivating E.coli part 1

    1. Pouring out agar plates..
    2. Streaking plates with E.coli..
    3. Put plates in incubation at 37’C for 15 hours max (put in at 6.08pm.).

      4. 26/07/17

      Cultivating E.coli part 2 (Round 1)

    4. Pick single colony of the cells from the LB agar plate into 10 ml of LB media containing no antibiotics OR specific for cell type..
    5. Grew the cultures overnight at 37’C with shaking incubator at 250 rpm..

      6. Pre pouring reagents for competent cells

    6. 0.1 M MgCl2 solution: 2.033g of MgCl2 6H2O in 100 ml H20 in a 100ml Pyrex Bottle..
    7. 0.1 M CaCl2 solution: 11g of Cacl2 in 500ml H20 in a 500ml Pyrex Bottle..
    8. 50% Glycerol solution: 10 ml of glycerol & 10ml H20 in 20ml culture tube with screw cup, autoclave at 4’C..

      9. 27/07/2017

      Competent cells (Round 1)

    9. Inoculate 200 mL of pre-warmed to 37 degrees C LB medium (w/out antibiotics) with 10 mL of overnight E.coli cultures..
    10. Incubate at 37 degrees C for 60 min with vigorous shaking 250 rpm or until OD600 is 0.4-0.5..
    11. Put flask on ice for 30 min. At the same time chill sterile falcon tubes..
    12. Aliquot culture into 50 mL each falcon tube (4x50).
    13. Harvest cells by centrifugation for 7 min at 3,500 rpm at 4 degrees C and discard supernatant.
    14. Resuspend cells with 12.5mL of MgCl2.
    15. Centrifuge for 7 min at 3,500rpm at 4 degrees C and discard supernatant.
    16. Resuspend cells with 25 mL of CaCl2 then incubate on ice for 30 min..
    17. Centrifuge for 7min at 3,500rpm at 4 degrees C and discard supernatant.
    18. Resuspend cells with 700 microL of CaCl2 and 300 microL of 50% glycerol. Final volume 1 mL..
    19. Aliquot 50 microL aliquots into 1.5mL sterile eppendorf tubes and store at -80 degrees C..

      20. Table of measured OD (during step 2):

      Time (min)

      OD600 batch 1

      OD600 batch 2

      0

      0

      0

      15

      0.043

      0.047

      30

      0.031

      0.012

      45

      0.065

      0.005

      60

      0.108

      /

      75

      0.150

      /

      90

      0.422

      /

      NB: Calibrate with LB before inoculation, not with water.