Difference between revisions of "Team:KU Leuven/Protocols"

 
(46 intermediate revisions by 3 users not shown)
Line 1: Line 1:
-{{KU_Leuven}}
+
{{KU_Leuven}}
 
<html>
 
<html>
 
<style type="text/css">
 
<style type="text/css">
Line 12: Line 12:
 
             box-shadow: 0px 3px 5px 2px rgba(0, 0, 0, 0.25);
 
             box-shadow: 0px 3px 5px 2px rgba(0, 0, 0, 0.25);
 
         }
 
         }
 
+
        p.head::first-letter {
 +
            color: #cc3333;
 +
            font-size: 40px;
 +
        }
 
         #experiments .header div {
 
         #experiments .header div {
 
             display: table;
 
             display: table;
Line 32: Line 35:
  
 
         }
 
         }
#experiments .table {
+
        #experiments .table {
display: table;
+
            display: table;
border-collapse: separate;
+
            border-collapse: separate;
border-spacing: 2px;
+
            border-spacing: 2px;
border-color: gray;
+
            border-color: gray;
}
+
        }
 
         table {
 
         table {
 
             table-layout: fixed
 
             table-layout: fixed
Line 43: Line 46:
  
 
         #experiments .content {
 
         #experiments .content {
             margin: 0 20px;
+
             margin: -30px 20px;
 
             position: relative;
 
             position: relative;
 
             z-index: 10;
 
             z-index: 10;
Line 56: Line 59:
 
             padding: 10px;
 
             padding: 10px;
 
         }
 
         }
 +
 +
        h4 {
 +
            margin-bottom: 10px;
 +
        }
 +
        .background{
 +
            background:url(https://static.igem.org/mediawiki/2017/c/cb/KU_Leuven_Homepage2.png);
 +
            position: initial;
 +
            background-size: 100%;
 +
            padding: 0 10px 0 10px;
 +
        }
 +
 +
        #grad {
 +
    background: -webkit-linear-gradient(#faebd7,#faeddb,#fbefdf,#fbf1e3,#fcf3e7,#fcf5eb,#fdf7ef,#f2f2f2); /* Safari 5.1-6.0 */
 +
    background: -o-linear-gradient((#faebd7,#faeddb,#fbefdf,#fbf1e3,#fcf3e7,#fcf5eb,#fdf7ef,#f2f2f2)); /* Opera 11.1-12.0 */
 +
    background: -moz-linear-gradient((#faebd7,#faeddb,#fbefdf,#fbf1e3,#fcf3e7,#fcf5eb,#fdf7ef,#f2f2f2)); /* Firefox 3.6-15 */
 +
    background: linear-gradient((#faebd7,#faeddb,#fbefdf,#fbf1e3,#fcf3e7,#fcf5eb,#fdf7ef,#f2f2f2)); /* Standard syntax */
 +
    }
 +
       
 +
        p {
 +
          text-align:justify;
 +
          font-size: 20px;
 +
        }
 +
       
  
 
         </style>
 
         </style>
 
         <script type="text/javascript" src="https://2017.igem.org/Template:KU_Leuven/flip?action=raw&ctype=text/javascript"></script>
 
         <script type="text/javascript" src="https://2017.igem.org/Template:KU_Leuven/flip?action=raw&ctype=text/javascript"></script>
        <div class="team">
 
            <div class="jumbotron">
 
                <div class="container">
 
                    <h1>Protocols</h1>
 
                    <p style="text-align:justify" ;>
 
                        In the lab, we used different experimental procedures. There are protocols for the wet and bacterial lab, for the cell culture lab and for the electrophysiology lab.
 
  
                    </p>
+
    <div id="grad">
                </div>
+
                         <br>
            </div>
+
                                 <div class="background">
            <div class="container">
+
                                    <h1 style="text-align:center; padding: 30px; font-size:50px; color: white;">Protocols</h1>
                <div id="experiments">
+
                                     <p class="head" style="text-align:center;color: white; padding: 10px 10px 60px 10px; font-size:15px;">
                    <div class="experiment">
+
                                         In the lab, we used different experimental procedures. There are protocols for the wet and bacterial lab, for the cell culture lab and for the electrophysiology lab.
                         <div class="header">
+
                            <div>
+
                                 <h3>Cell Culture</h3>
+
                            </div>
+
                        </div>
+
                        <div class="content" style="display: none;">
+
                            <p style="text-align:justify">
+
                            <h2><b>Medium of HEK 293 cells </b></h2>
+
                                     <h4><b>Medium contents</b></h4>
+
                                        <ul>
+
                                            <li>DMEM (Gibco N° 41965-039) 500 ml<li>
+
                                            <li>50 ml  (10 %)  FCS = (Hyclone)</li>
+
                                            <li>10 ml Penicillin/Streptomycin (Gibco N° 15070-071) = 100-100U/ml</li>
+
                                            <li>10 ml Glutamax (Gibco N° 35050-038) = 10 mM</li>
+
                                            <li>5 ml Non-Essential-Amino-Acids (Gibco N° 1140-035) = 10x</li>
+
                                         </ul>
+
                     
+
                                    <h4><b>Growing conditions</b></h4>
+
                                        <ul>       
+
                                            <li>Incubate at 37°C and 10% CO<sub>2</sub></li>
+
                                            <li>Split cells around 70-90% confluency</li>
+
                                            <li>Change medium twice a week</li>
+
                                        </ul>
+
  
                             <h2><b>Standard procedure for trypsinization</b></h2>
+
                                    </p>
                            </br>
+
                                </div>
                                        <ul>
+
                              
                                            <li>Wash the cells with Versene (Gibco N° 15040-033, ± 2 min)</li>
+
                            <div class="container">
                                            <li>Remove versene and add Trypsin (Gibco N° 25300-096)</li>
+
                                <div id="experiments">
                                            <li>Incubate at 37°C (around 3-5 min)</li>
+
                                    <div class="experiment">
                                            <li>Stop the trypsinization by adding 5-10 times volume of medium</li>
+
                                        <div class="header">
                                            <li>Count cells</li>
+
                                            <div>
                                            <li>Centrifuge for 5 minutes at 1200 rpm</li>
+
                                                <h3>Cell Culture</h3>
                                            <li>Aspirate supernatant and resuspend the cells in medium</li>
+
                                            </div>
                                            <li>Plate cells for experiments or culture</li>
+
                                        </div>
                                        </ul>
+
                                        <div class="content" style="display: none;">
 +
                                            <p style="text-align:justify">
 +
                                            <h2><b>Medium of HEK 293 cells </b></h2>
 +
                                                    <h4><b>Medium contents</b></h4>
 +
                                                        <ul>
 +
                                                            <li>DMEM (Gibco N° 41965-039) 500 ml<li>
 +
                                                            <li>50 ml  (10 %)  FCS = (Hyclone)</li>
 +
                                                            <li>10 ml Penicillin/Streptomycin (Gibco N° 15070-071) = 100-100U/ml</li>
 +
                                                            <li>10 ml Glutamax (Gibco N° 35050-038) = 10 mM</li>
 +
                                                            <li>5 ml Non-Essential-Amino-Acids (Gibco N° 1140-035) = 10x</li>
 +
                                                        </ul>
 +
                                     
 +
                                                    <h4><b>Growing conditions</b></h4>
 +
                                                        <ul>       
 +
                                                            <li>Incubate at 37°C and 10% CO<sub>2</sub></li>
 +
                                                            <li>Split cells around 70-90% confluency</li>
 +
                                                            <li>Change medium twice a week</li>
 +
                                                        </ul>
  
                            <h2><b>Coating of glass coverslips (for patch-clamp or Ca<sup>2+</sup> imaging)</b></h2>
+
                                            <h2><b>Standard procedure for trypsinization</b></h2>
                                    <h5><b>Poly-L-lysine</b> (PLL, sigma P2636)</h5>
+
                                            </br>
                                        <ul>
+
                                                        <ul>
                                            <li>Dissolved at 0.1 mg/ml in Milli-Q H<sub>2</sub>O</li>
+
                                                            <li>Wash the cells with Versene (Gibco N° 15040-033, ± 2 min)</li>
                                            <li>Stored at –20°C</li>
+
                                                            <li>Remove versene and add Trypsin (Gibco N° 25300-096)</li>
                                            <li>Once opened stored at RT</li>
+
                                                            <li>Incubate at 37°C (around 3-5 min)</li>
                                        </ul>
+
                                                            <li>Stop the trypsinization by adding 5-10 times volume of medium</li>
                                    <h5><b>Coverslips</b> (18mm)</h5>
+
                                                            <li>Count cells</li>
                                        <ul>
+
                                                            <li>Centrifuge for 5 minutes at 1200 rpm</li>
                                            <li>Prepare 12-well plates with a coverslip in each well</li>
+
                                                            <li>Aspirate supernatant and resuspend the cells in medium</li>
                                            <li>Transfer 1 sterilized coverslip to each well</li>
+
                                                            <li>Plate cells for experiments or culture</li>
                                            <li>Add 350 ml of PLL to each coverslip</li>
+
                                                        </ul>
                                            <li>Incubate for 20 minutes at RT</li>
+
                                                       
                                            <li>Aspirate and add Milli-Q H<sub>2</sub>O to each coverslip</li>
+
                                            <h2><b>Transfection Lipofectamine 3000</b></h2>
                                            <li>Incubate for 20 minutes at RT</li>
+
                                            </br>
                                            <li>Aspirate H<sub>2</sub>O and store for experiments. The plates can be kept for several days at 4°C.</li>
+
                                                        <ul>
                                        </ul>
+
                                                            <li>Seed cells to be 70–90% confluent at transfection</li>
                            <h2><b>Seeding Cells</b></h2>
+
                                                            <li>Dilute Lipofectamine Reagent in Opti-MEM Medium and mix well</li>
                                    <h4><b>Seeding cells for single-cell experiments</b></h4>
+
                                                            <li>prepare mastermix of DNA (0,5 - 5 μg/μl) by diluting DNA in Opti-MEM Medium, then add P3000 (2 μl/μg DNA) Reagent and Mix wel</li>
                                        <ul>
+
                                                            <li>Add diluted DNA to each tube of diluted Lipofectamine Reagent (1:1 ratio)</li>
                                            <li>Spray your hands with ethanol, take the 6 well plate with cells out of the incubator and check the density of the cells</li>
+
                                                            <li>Incubate for 5 minutes at room temperature</li>
                                            <li>Place the cells under the flow</li>
+
                                                            <li>Add DNA-lipid complex to cells</li>
                                            <li>Remove the medium</li>
+
                                                            <li>Visualize/analyze transfected cells. Incubate cells for 2–4 days at 37°C. Then, analyze transfected cells.</li>
                                            <li>Wash the cells with 1 ml of versene for 2 minutes</li>
+
                                                            <br>
                                            <li>Remove versene and add 500μl of trypsin</li>
+
                                                            <li> for more information: see <a href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/life-sciences/CellCultureandTransfection/pdfs/Lipofectamine_3000_Protocol_6Dec2013.pdf?icid=cvc-lipofectamine-c2m2">thermofisher.com</a>
                                            <li>Incubate at 37°C, 10% CO2 for about 5-10 minutes</li>
+
                                                           
                                            <li>Stop the trypsinization by adding 5 ml of medium.</li>
+
                                                        </ul>
                                            <li>Transfer cell suspension to a 50 ml Falcon tube</li>
+
                                           
                                            <li>Separate the cells by pulling them with a 5 ml syringe through a black needle of 22G (5-10 times)</li>
+
                                            <h2><b>Coating of glass coverslips (for patch-clamp or Ca<sup>2+</sup> imaging)</b></h2>
                                        </ul>
+
                                                    <h5><b>Poly-L-lysine</b> (PLL, sigma P2636)</h5>
                                    <h4><b>I. Ca<sup>2+</sup> imaging</b></h4>
+
                                                        <ul>
                                        <ul>
+
                                                            <li>Dissolved at 0.1 mg/ml in Milli-Q H<sub>2</sub>O</li>
                                            <li><i>Cells are typically seeded in a 12-well plate with PLL coated round coverslips of 18 mm</i></li>
+
                                                            <li>Stored at –20°C</li>
                                            <li>Add 1 ml of medium to each 12-well of your plate</li>
+
                                                            <li>Once opened stored at RT</li>
                                            <li>If the cells in the 6-well had a density of 95-100%, typically seed 400-500 microliters of cell suspension per 12-well (density depending on experimental needs)</li>
+
                                                        </ul>
                                            <li>Incubate at least 2 hours for cell attachment to the coverslip</li>
+
                                                    <h5><b>Coverslips</b> (18mm)</h5>
                                        </ul>
+
                                                        <ul>
                                    <h4><b>II. Patch clamp</b></h4>
+
                                                            <li>Prepare 12-well plates with a coverslip in each well</li>
                                        <ul>
+
                                                            <li>Transfer 1 sterilized coverslip to each well</li>
                                            <li><i>Cells are typically seeded in a 12-well plate, on PLL coated round coverslips of 18 mm</i></li>
+
                                                            <li>Add 350 ml of PLL to each coverslip</li>
                                            <li>Add 1 ml of medium to each 12-well of your plate</li>
+
                                                            <li>Incubate for 20 minutes at RT</li>
                                            <li>If the cells in the 6-well had a density of 95-100%, typically seed 100-300 microliters of cells per 12-well (density depending on experimental needs)</li>
+
                                                            <li>Aspirate and add Milli-Q H<sub>2</sub>O to each coverslip</li>
                                            <li>Incubate at least 2 hours for cell attachment to the coverslip</li>
+
                                                            <li>Incubate for 20 minutes at RT</li>
                                        </ul>
+
                                                            <li>Aspirate H<sub>2</sub>O and store for experiments. The plates can be kept for several days at 4°C.</li>
                            </p>
+
                                                        </ul>
                        </div>
+
                                            <h2><b>Seeding Cells</b></h2>
                    </div>
+
                                                    <h4><b>Seeding cells for single-cell experiments</b></h4>
</br>
+
                                                        <ul>
                    <div class="experiment">
+
                                                            <li>Spray your hands with ethanol, take the 6 well plate with cells out of the incubator and check the density of the cells</li>
                        <div class="header">
+
                                                            <li>Place the cells under the flow</li>
                            <div>
+
                                                            <li>Remove the medium</li>
                                <h3>Wet Lab</h3>
+
                                                            <li>Wash the cells with 1 ml of versene for 2 minutes</li>
                            </div>
+
                                                            <li>Remove versene and add 500μl of trypsin</li>
                        </div>
+
                                                            <li>Incubate at 37°C, 10% CO2 for about 5-10 minutes</li>
                        <div class="content" style="display: none;">
+
                                                            <li>Stop the trypsinization by adding 5 ml of medium.</li>
                            <p style="text-align:justify">
+
                                                            <li>Transfer cell suspension to a 50 ml Falcon tube</li>
                            <h2><b>Transformation of MAX Efficiency™ DH5α™ Competent Cells</b></h2>   
+
                                                            <li>Separate the cells by pulling them with a 5 ml syringe through a black needle of 22G (5-10 times)</li>
                                    <h4>Day 1</h4>
+
                                                        </ul>
                                        <ul>
+
                                                    <h4><b>I. Ca<sup>2+</sup> imaging</b></h4>
                                            <li>Add 25µL of bacteria to the bottom of a polypropylene 14mL Falcon tube (352059). Place on ice.</li>  
+
                                                        <ul>
                                            <li>Add either 0.5µL of 100ng/µL plasmid or 1 to 5µL of a ligation mix to the bacteria. Mix gently by shaking. Leave on ice for 30 minutes</li>
+
                                                            <li><i>Cells are typically seeded in a 12-well plate with PLL coated round coverslips of 18 mm</i></li>
                                            <li>Preheat the SOC medium and waterbath to 42ºC. </li>
+
                                                            <li>Add 1 ml of medium to each 12-well of your plate</li>
                                            <li>Perform a heat shock. Place cells at 42ºC for 30 to 45 seconds. Return to ice for 2 minutes.</li>
+
                                                            <li>If the cells in the 6-well had a density of 95-100%, typically seed 400-500 microliters of cell suspension per 12-well (density depending on experimental needs)</li>
                                            <li>Add 0.5mL SOC medium.</li>
+
                                                            <li>Incubate at least 2 hours for cell attachment to the coverslip</li>
                                            <li>Place in shaking incubator at 37ºC for 1 hour.</li>
+
                                                        </ul>
                                            <li>Plate and spread on plates containing 50µg/mL of a specific antibiotic resistance markers. Incubate overnight at 37ºC for maximum 16 hours.</li>  
+
                                                    <h4><b>II. Patch clamp</b></h4>
                                        </ul>
+
                                                        <ul>
                                    <h4>Day 2</h4>
+
                                                            <li><i>Cells are typically seeded in a 12-well plate, on PLL coated round coverslips of 18 mm</i></li>
                                        <ul>
+
                                                            <li>Add 1 ml of medium to each 12-well of your plate</li>
                                            <li>Add 3mL of LB medium containing 50µg/mL of a specific antibiotic resistance marker to a 14mL polystyrene Falcon tube (352057).</li>
+
                                                            <li>If the cells in the 6-well had a density of 95-100%, typically seed 100-300 microliters of cells per 12-well (density depending on experimental needs)</li>
                                            <li>Pick a single colony using a Inoculation loop. Transfer colony into medium and shake. In order to perform a miniprep, grow at 37ºC overnight and skip to 'Day 3'. Otherwise, grow for 3 to 4 hours and continue.</li>
+
                                                            <li>Incubate at least 2 hours for cell attachment to the coverslip</li>
                                            <li>Add 70mL LB medium containing 50µg/mL of a specific antibiotic resistance marker to a sterile erlenmeyer.</li>
+
                                                        </ul>
                                            <li>Add the bacteria to the new medium: ½ of the medium in the Falcon if the growth is visible, all of the medium if the solution is still clear.</li>
+
                                            </p>
                                            <li>Place erlenmeyers in shaking incubator at 37ºC overnight or for maximum 16 hours.</li>
+
                                        </div>
                                        </ul>   
+
                                    </div>
                                    <h4>Day 3</h4>
+
                </br>
                                        <ul>
+
                                    <div class="experiment">
                                            <li>Harvest plasmids using mini-, midi- or maxiprep kit.</li>
+
                                        <div class="header">
                                        </ul>   
+
                                            <div>
                            <h2><b>PCR</b></h2>
+
                                                <h3>Wet Lab</h3>
<h4><b>Reaction mixture</b></h4>
+
                                            </div>
<table>
+
                                        </div>
<tr>
+
                                        <div class="content" style="display: none;">
<th>Product</th>
+
                                            <p style="text-align:justify">
<th>Final concentration</th>
+
                                            <h2><b>Transformation of MAX Efficiency™ DH5α™ Competent Cells</b></h2>   
<th>Volume for 50µL reaction</th>
+
                                                    <h4>Day 1</h4>
</tr>
+
                                                        <ul>
<tr>
+
                                                            <li>Add 25µL of bacteria to the bottom of a polypropylene 14mL Falcon tube (352059). Place on ice.</li>  
<td>5x Phusion buffer HF</td>
+
                                                            <li>Add either 0.5µL of 100ng/µL plasmid or 1 to 5µL of a ligation mix to the bacteria. Mix gently by shaking. Leave on ice for 30 minutes</li>
<td>1x</td>
+
                                                            <li>Preheat the SOC medium and waterbath to 42ºC. </li>
<td>10µL</td>
+
                                                            <li>Perform a heat shock. Place cells at 42ºC for 30 to 45 seconds. Return to ice for 2 minutes.</li>
</tr>
+
                                                            <li>Add 0.5mL SOC medium.</li>
<tr>
+
                                                            <li>Place in shaking incubator at 37ºC for 1 hour.</li>
<td>dNTPs (10mM)</td>
+
                                                            <li>Plate and spread on plates containing 50µg/mL of a specific antibiotic resistance markers. Incubate overnight at 37ºC for maximum 16 hours.</li>  
<td>200µM each</td>
+
                                                        </ul>
<td>1µL</td>
+
                                                    <h4>Day 2</h4>
</tr>
+
                                                        <ul>
<tr>
+
                                                            <li>Add 3mL of LB medium containing 50µg/mL of a specific antibiotic resistance marker to a 14mL polystyrene Falcon tube (352057).</li>
<td>Forward primer (25µM)</td>
+
                                                            <li>Pick a single colony using a Inoculation loop. Transfer colony into medium and shake. In order to perform a miniprep, grow at 37ºC overnight and skip to 'Day 3'. Otherwise, grow for 3 to 4 hours and continue.</li>
<td>0.5µM</td>
+
                                                            <li>Add 70mL LB medium containing 50µg/mL of a specific antibiotic resistance marker to a sterile erlenmeyer.</li>
<td>1µL</td>
+
                                                            <li>Add the bacteria to the new medium: ½ of the medium in the Falcon if the growth is visible, all of the medium if the solution is still clear.</li>
</tr>
+
                                                            <li>Place erlenmeyers in shaking incubator at 37ºC overnight or for maximum 16 hours.</li>
<tr>
+
                                                        </ul>   
<td>Reverse primer (25µM)</td>
+
                                                    <h4>Day 3</h4>
<td>0.5µM</td>
+
                                                        <ul>
<td>1µL</td>
+
                                                            <li>Harvest plasmids using mini-, midi- or maxiprep kit.</li>
</tr>
+
                                                        </ul>   
<tr>
+
                                            <h2><b>PCR</b></h2>
<td>Template DNA</td>
+
                                                    <h4><b>Reaction mixture</b></h4>
<td> </td>
+
                                                        <table>
<td>1µL</td>
+
                                                            <tr>
</tr>
+
                                                                <th>Product</th>
<tr>
+
                                                                <th>Final concentration</th>
<td>Phusion DNA polymerase</td>
+
                                                                <th>Volume for 50µL reaction</th>
<td>0.02U/µL</td>
+
                                                            </tr>
<td>0.5µL</td>
+
                                                            <tr>
</tr>
+
                                                                <td>5x Phusion buffer HF</td>
<tr>
+
                                                                <td>1x</td>
<td>Milli-Q Water</td>
+
                                                                <td>10µL</td>
<td> </td>
+
                                                            </tr>
<td>35.5µL</td>
+
                                                            <tr>
</tr>
+
                                                                <td>dNTPs (10mM)</td>
</table>
+
                                                                <td>200µM each</td>
<h4><b>Protocol</b></h4>
+
                                                                <td>1µL</td>
<table>
+
                                                            </tr>
<tr>
+
                                                            <tr>
<th>Step</th>
+
                                                                <td>Forward primer (25µM)</td>
<th>Time</th>
+
                                                                <td>0.5µM</td>
<th>Temperature</th>
+
                                                                <td>1µL</td>
<th>Number of cycles</th>
+
                                                            </tr>
</tr>
+
                                                            <tr>
<tr>
+
                                                                <td>Reverse primer (25µM)</td>
<th>Initial denaturation</th>
+
                                                                <td>0.5µM</td>
<td>30’’</td>
+
                                                                <td>1µL</td>
<td>98ºC</td>
+
                                                            </tr>
<td>1</td>
+
                                                            <tr>
</tr>
+
                                                                <td>Template DNA</td>
<tr>
+
                                                                <td> </td>
<th>Denaturation</th>
+
                                                                <td>1µL</td>
<td>10’’</td>
+
                                                            </tr>
<td>98ºC</td>
+
                                                            <tr>
<td rowspan="3" style="vertical-align: middle;">30</td>
+
                                                                <td>Phusion DNA polymerase</td>
</tr>
+
                                                                <td>0.02U/µL</td>
<tr>
+
                                                                <td>0.5µL</td>
<th>Annealing</th>
+
                                                            </tr>
<td>30’’</td>
+
                                                            <tr>
<td>*ºC (*: 2 degrees beneath T<sub>m</sub>)</td>
+
                                                                <td>Milli-Q Water</td>
</tr>
+
                                                                <td> </td>
<tr>
+
                                                                <td>35.5µL</td>
<th>Extension</th>
+
                                                            </tr>
<td>3’30’’</td>
+
                                                        </table>
<td>72ºC</td>
+
                                                    <h4><b>Protocol</b></h4>
</tr>
+
                                                        <table>
<tr>
+
                                                            <tr>
<th>Final extension</th>
+
                                                                <td>Step</td>  
<td>7’</td>
+
                                                                <td>Time</td>
<td>72ºC</td>
+
                                                                <td>Temperature</td>  
<td rowspan="2" style="vertical-align: middle;">1</td>
+
                                                                <td>Number of cycles</td>
</tr>
+
                                                            </tr>
<tr>
+
                                                            <tr>
<th>End</th>
+
                                                                <td>Initial denaturation</td>
<td>-</td>
+
                                                                <td>30’’</td>
<td>4ºC</td>
+
                                                                <td>98ºC</td>
</tr>
+
                                                                <td>1</td>
</table>
+
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Denaturation</td>
 +
                                                                <td>10’’</td>
 +
                                                                <td>98ºC</td>
 +
                                                                <td rowspan="3" style="vertical-align: middle;">30</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Annealing</td>
 +
                                                                <td>30’’</td>  
 +
                                                                <td>*ºC (*: 2 degrees below T<sub>m</sub>)</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Extension</td>
 +
                                                                <td>3’30’’</td>
 +
                                                                <td>72ºC</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Final extension</td>
 +
                                                                <td>7’</td>
 +
                                                                <td>72ºC</td>  
 +
                                                                <td rowspan="2" style="vertical-align: middle;">1</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>End</td>
 +
                                                                <td>-</td>
 +
                                                                <td>4ºC</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                        </table>
  
  
Line 279: Line 321:
  
  
                                <br/>  
+
                                                <br/>  
                            </p>
+
                                            </p>
                        </div>
+
                                        </div>
 +
                <br>
 +
                                        <div class="experiment">
 +
                                        <div class="header">
 +
                                            <div>
 +
                                                <h3>Patch Clamp</h3>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                        <div class="content" style="display: none;">
 +
                                            <p style="text-align:justify">
 +
                                            <h2><b>Methods</b></h2>
 +
                                               
 +
                                                    <ul>
 +
                                                        <li>We used whole-cell patch clamp to measure the membrane voltage and ion currents across a HEK cell membrane. To measure whole-cell, we pushed a glass pipette against the  membrane of a cell, to seal the membrane completely against the membrane. Afterwards, we caused a sudden negative pressure in the glass pipette, which destroys the membrane in the opening of the glass pipette. The solution within the pipette will subsequentially mix with the intracellular compartment of the cell, which allows us to measure with a pre-defined intracellular buffer.</li>
 +
                                                    </ul>
 +
                                            <h4>Voltage clamp</h4>
 +
                                                        <ul>
 +
                                                            <li>To study the currents through different ion channels with whole-cell patch clamp, we used a specific technique called "Voltage clamp". Here, we maintain a pre-defined membrane potential to study the activation of α1G, HCN2 and hERG. Each of these ion channels has a specific way of activation, which can be quantified using voltage clamp. When clamping the voltage at a certain value, a cell will adapt to the voltage by increasing or decreasing ion currents. These currents will be measured using this technique </li>
 +
                                                        </ul>
 +
                                            <h4>Current clamp</h4>
 +
                                                        <ul>
 +
                                                            <li>When trying to measure an oscillation in the cell membrane with patch-clamp, you cannot use voltage-clamp, since this technique doesn't allow the cell to change its membrane potential. We used current-clamp instead. Here, you can inject a pre-defined current into the cell which allows you to see how the membrane potential of the cell responds to the current. When a cell oscillates by itself, the membrane potential will oscillate while injecting 0 current. However, we often needed to inject a small negative current (-300pA) into a cell to elicit an oscillation in a cell with an extracellular Krebs solution.</li>
 +
                                                        </ul>
 
<br>
 
<br>
                        <div class="experiment">
+
                                    </div>
                        <div class="header">
+
</div>
                            <div>
+
 
                                <h3>Electrophysiology</h3>
+
                <br>
 +
                                    <div class="experiment">
 +
                                        <div class="header">
 +
                                            <div>
 +
                                                <h3>Calcium imaging</h3>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                        <div class="content" style="display: none;">
 +
                                            <p style="text-align:justify">
 +
                                                <ul>
 +
                                                                                        <br>
 +
                                                                                            <br>
 +
                                                            <li> Calcium imaging is a scientific technique which can be used to measure and follow the calcium ions inside and/or outside the cell. We used a specific dye (Fura2-AM) to follow the calcium ions by the rate of fluorescence. For our project, we only used the calcium imaging for testing whether there were oscillations or not and what potassium concentrations (in a krebs buffer) were needed. We did not mathematically analyse the data we received. We only used it as a criteria for the patch clamp.</li> </p>
 +
                                                </ul>
 +
 
 +
                                            <h2><b>Preparation of imaging</b></h2>
 +
                                                    <h5><b>Fura-2, AM</b> (MW: 1001,9)</h5>
 +
                                                        <ul>
 +
                                                            <li>Dilute 50 μg of Fura-2 in 50 μl DMSO (1 mM stock solution)</li>
 +
                                                            <li>Make aliquots of 2 μl in brown eppies and store at -20°C</li>
 +
                                                            <li>To load cells (1 well): add 2 μl of Fura-2 to 1 ml of medium (2μM work solution)</li>
 +
                                                            <li>Incubate cells for 30 minutes before measurement</li>
 +
                                                            <br>
 +
                                                        </ul>
 +
                                                                         
 +
                                    </div>
 +
                <br>
 +
                                    <div class="experiment">
 +
                                        <div class="header" style="margin: 0 0 30px;">
 +
                                            <div>
 +
                                                <h3>Intra- and extracellular buffers </h3>
 +
                                            </div>
 +
                                        </div>
 +
                                        <div class="content" style="display: none;" width=80% >
 +
                                            <p style="text-align:justify">
 +
                                            <h2>Buffers for stable HEK-HCN cells</h2>
 +
                                            <br>
 +
                                           
 +
                                                <div class="table">
 +
                                                    <table>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>External Solution</td>
 +
                                                                <td>MW (g/mol)</td>
 +
                                                                <td>mM</td>
 +
                                                                <td>g/l</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>NaCl</td>
 +
                                                                <td>58,44</td>
 +
                                                                <td>150</td>
 +
                                                                <td>8,766</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>KCl</td>
 +
                                                                <td>74,56</td>
 +
                                                                <td>10</td>
 +
                                                                <td>0,7456</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>CaCl<sub>2</sub> x 2H<sub>2</sub>O</td>
 +
                                                                <td>147,02</td>
 +
                                                                <td>3</td>
 +
                                                                <td>0,44106</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>MgCl<sub>2</sub> x 6H<sub>2</sub>O</td>
 +
                                                                <td>203,3</td>
 +
                                                                <td>1</td>
 +
                                                                <td>0,2033</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Hepes</td>
 +
                                                                <td>238,31</td>
 +
                                                                <td>10</td>
 +
                                                                <td>2,3831</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>pH 7.4 NaOH</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                        </table>
 +
                                                        <br>
 +
                                                        <table>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Pipetsolution</td>
 +
                                                                <td>MW (g/mol)</td>
 +
                                                                <td>mM</td>
 +
                                                                <td>g/100 ml</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>KCl</td>
 +
                                                                <td>74,56</td>
 +
                                                                <td>150</td>
 +
                                                                <td>1,1184</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>MgCl<sub>2</sub> x 6H<sub>2</sub>O</td>
 +
                                                                <td>203,3</td>
 +
                                                                <td>0,5</td>
 +
                                                                <td>0,010165</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Hepes</td>
 +
                                                                <td>238,31</td>
 +
                                                                <td>10</td>
 +
                                                                <td>0,23831</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>EGTA</td>
 +
                                                                <td>380,35</td>
 +
                                                                <td>1</td>
 +
                                                                <td>0,038035</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>pH 7.4 KOH</td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                        </table>
 +
                                                        <table>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Activator HCN: 100 µM cAMP MM 329,21 g/mol</td>
 +
                                                                <td> Stock 30 mM: 0,01g/ml </td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                            <tr>
 +
                                                                <td>Blokker HCN: 10 mM CsCl<sub>2</sub> MM 168,37 g/mol</td>
 +
                                                                <td>Stock 1 M: 0,168 g/ml </td>
 +
                                                            </tr>
 +
                                                        </table>
 +
                                                        <br>
 +
                                                        <h2>Buffers for transfected HEK-HCN and HEK-hERG cells</h2>
 +
                                                        <br>
 +
                                                        <table>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>Krebs</td>
 +
                                                            <td>MW (g/mol)</td>
 +
                                                            <td>mM</td>
 +
                                                            <td>g/l</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>NaCl</td>
 +
                                                            <td>58,44</td>
 +
                                                            <td>150</td>
 +
                                                            <td>8,766</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>KCl</td>
 +
                                                            <td>74,56</td>
 +
                                                            <td>5</td>
 +
                                                            <td>0,3728</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>CaCl<sub>2</sub> x 2H<sub>2</sub>O</td>
 +
                                                            <td>147,02</td>
 +
                                                            <td>2</td>
 +
                                                            <td>0,29404</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>MgCl<sub>2</sub> x 6H<sub>2</sub>O</td>
 +
                                                            <td>203,3</td>
 +
                                                            <td>1,5</td>
 +
                                                            <td>0,30495</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>Hepes</td>
 +
                                                            <td>238,31</td>
 +
                                                            <td>10</td>
 +
                                                            <td>2,3831</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>Glucose monohydrate</td>
 +
                                                            <td>198,17</td>
 +
                                                            <td>10</td>
 +
                                                            <td>1,9817</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>pH 7.4 NaOH</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        </table>
 +
                                                        <br>
 +
                                                        <table>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>K-Sol</td>
 +
                                                            <td>MW (g/mol)</b></td>
 +
                                                            <td>mM</td>
 +
                                                            <td>g/l</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>NaCl</td>
 +
                                                            <td>58,44</td>
 +
                                                            <td>0</td>
 +
                                                            <td>0</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>KCl</td>
 +
                                                            <td>74,56</td>
 +
                                                            <td>155</td>
 +
                                                            <td>11,5568</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>CaCl<sub>2</sub> x 2H<sub>2</sub>O</td>
 +
                                                            <td>147,02</td>
 +
                                                            <td>2</td>
 +
                                                            <td>0,29404</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>MgCl<sub>2</sub> x 6H<sub>2</sub>O</td>
 +
                                                            <td>203,3</td>
 +
                                                            <td>1,5</td>
 +
                                                            <td>0,30495</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>Hepes</td>
 +
                                                            <td>238,31</td>
 +
                                                            <td>10</td>
 +
                                                            <td>2,3831</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>Glucose monohydrate</td>
 +
                                                            <td>198,17</td>
 +
                                                            <td>10</td>
 +
                                                            <td>1,9817</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>pH 7.4 NaOH</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                    </table>
 +
                                                    <br>
 +
                                                    <ul>
 +
                                                        <li>The Na<sup>+</sup> and K<sup>+</sup> concentration is always 155 mM and when we made another buffer with another K <sup>+</sup>-concentration, the Na <sup>+</sup> concentration changes with it. The other components remained the same. (The most useful K <sup>+</sup> concentration is between 1 and 5 mM.)</li>
 +
                                                    </ul>
 +
                                                    <br>
 +
                                                    <table>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>Pipetsolution</td>
 +
                                                            <td>MW (g/mol)</td>
 +
                                                            <td>mM</td>
 +
                                                            <td>g/100 ml</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>KCl</td>
 +
                                                            <td>74,56</td>
 +
                                                            <td>150</td>
 +
                                                            <td>1,1184</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>Hepes</td>
 +
                                                            <td>238,31</td>
 +
                                                            <td>10</td>
 +
                                                            <td>0,23831</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>MgCl<sub>2</sub> x 6H<sub>2</sub>O</td>
 +
                                                            <td>203,3</td>
 +
                                                            <td>0,5</td>
 +
                                                            <td>0,010165</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>EGTA</td>
 +
                                                            <td>380,35</td>
 +
                                                            <td>1</td>
 +
                                                            <td>0,038035</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <th>pH 7.4 with KOH</th>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                    </table>
 +
                                                    <br>
 +
                                                    <h2>Buffers for TRPM3 cells</h2>
 +
                                                    <br>
 +
                                                    <table>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>external solution</td>
 +
                                                            <td>MW (g/mol)</td>
 +
                                                            <td>mM</td>
 +
                                                            <td>g/100 ml</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>NaCl</td>
 +
                                                            <td>58,44</td>
 +
                                                            <td>150</td>
 +
                                                            <td>8,77</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>MgCl<sub>2</sub> x 6H<sub>2</sub>O</td>
 +
                                                            <td>203,3</td>
 +
                                                            <td>1</td>
 +
                                                            <td>0,2</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>Hepes</td>
 +
                                                            <td>238,31</td>
 +
                                                            <td>10</td>
 +
                                                            <td>2,38</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>pH 7.4 with NaOH</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                    </table>
 +
                                                    <br>
 +
                                                    <table>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>Pipet solution</td>
 +
                                                            <td>MW (g/mol)</td>
 +
                                                            <td>mM</td>
 +
                                                            <td>g/100 ml</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>dl-Asp</td>
 +
                                                            <td>133,1</td>
 +
                                                            <td>100</td>
 +
                                                            <td>1,331</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>CsCl</td>
 +
                                                            <td>168,36</td>
 +
                                                            <td>45</td>
 +
                                                            <td>0,757</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>Hepes</td>
 +
                                                            <td>238,31</td>
 +
                                                            <td>10</td>
 +
                                                            <td>0,238</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>MgCl<sub>2</sub> x 6H<sub>2</sub>O</td>
 +
                                                            <td>203,3</td>
 +
                                                            <td>1</td>
 +
                                                            <td>0,0203</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>EGTA</td>
 +
                                                            <td>380,35</td>
 +
                                                            <td>10</td>
 +
                                                            <td>0,38</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                        <tr>
 +
                                                            <td>pH 7.4 with CsOH</td>
 +
                                                        </tr>
 +
                                                    </table>
 +
                                                    <br>
 +
                                                </div>
 +
                                        </div>
 +
                                    </div>
 
                             </div>
 
                             </div>
                        </div>
 
                        <div class="content" style="display: none;">
 
                            <p style="text-align:justify">
 
                            <h2><b>Methods - Patch Clamp</b></h2>
 
                               
 
                                    <ul>
 
                                        <li>We used whole-cell patch clamp to measure the membrane voltage and ion currents across a HEK cell membrane. To measure whole-cell, we pushed a glass pipette against the  membrane of a cell, to seal the membrane completely against the membrane. Afterwards, we caused a sudden negative pressure in the glass pipette, which destroys the membrane in the opening of the glass pipette. The solution within the pipette will subsequentially mix with the intracellular compartment of the cell, which allows us to measure with a pre-defined intracellular buffer.</li>
 
                                    </ul>
 
                            <h4>Voltage clamp</h4>
 
                                        <ul>
 
                                            <li>To study the currents through different ion channels with whole-cell patch clamp, we used a specific technique called "Voltage clamp". Here, we maintain a pre-defined membrane potential to study the activation of α1G, HCN2 and hERG. Each of these ion channels has a specific way of activation, which can be quantified using voltage clamp. When clamping the voltage at a certain value, a cell will adapt to the voltage by increasing or decreasing ion currents. These currents will be measured using this technique </li>
 
                                        </ul>
 
                            <h4>Current clamp</h4>
 
                                        <ul>
 
                                            <li>When trying to measure an oscillation in the cell membrane with patch-clamp, you cannot use voltage-clamp, since this technique doesn't allow the cell to change its membrane potential. We used current-clamp instead. Here, you can inject a pre-defined current into the cell which allows you to see how the membrane potential of the cell responds to the current. When a cell oscillates by itself, the membrane potential will oscillate while injecting 0 current. However, we often needed to inject a small negative current (-300pA) into a cell to elicit an oscillation in a cell with an extracellular Krebs solution.</li>
 
                                        </ul>
 
                    </div>
 
<br>
 
                        <div class="experiment">
 
                        <div class="header">
 
                            <div>
 
                                <h3>Calcium imaging</h3>
 
                            </div>
 
                        </div>
 
                        <div class="content" style="display: none;">
 
                            <p style="text-align:justify">
 
                            <h2><b>Preparation of imaging</b></h2>
 
                                    <h5><b>Fura-2, AM</b> (MW: 1001,9)</h5>
 
                                        <ul>
 
                                            <li>Dilute 50 μg of Fura-2 in 50 μl DMSO (1 mM stock solution)</li>
 
                                            <li>Make aliquots of 2 μl in brown eppies and store at -20°C</li>
 
                                            <li>To load cells (1 well): add 2 μl of Fura-2 to 1 ml of medium (2μM work solution)</li>
 
                                            <li>Incubate cells for 30 minutes before measurement</li>
 
                                        </ul>                   
 
                        </div>
 
<br>
 
    <div class="experiment">
 
                        <div class="header">
 
                            <div>
 
                                <h3>Intra- and extracellular buffers </h3>
 
                            </div>
 
                        </div>
 
                        <div class="content" style="display: none;" width=80% >
 
                            <p style="text-align:justify">
 
                            <h4>Intracellular Buffers</h4>
 
<br>
 
<div class="experiment">
 
<div class="table">
 
<table>
 
<tr>
 
<th><b>K-Sol</b></th>
 
<th><b>MW (g/mol)</b></th>
 
<th><b>mM</b></th>
 
<th><b>g/l</b></th>
 
</tr>
 
<tr>
 
<td><b>NaCl</b></td>
 
<td>58,44</td>
 
<td>0</td>
 
<td>0</td>
 
</tr>
 
<tr>
 
<td><b>KCl</b></td>
 
<td>74,56</td>
 
<td>155</td>
 
<td>11,5568</td>
 
</tr>
 
</table>
 
</div>
 
</div>
 
                            <h4>Extracellular Buffers</h4>
 
                    </div>
 
                </div>
 
            </div>
 
        </div>
 
    </div>
 
 
     </div>
 
     </div>
 +
 
     <script type="text/javascript">
 
     <script type="text/javascript">
 
     $(document).ready(function() { /* to make sure the script runs after page load */
 
     $(document).ready(function() { /* to make sure the script runs after page load */
Line 374: Line 704:
 
     });
 
     });
 
     </script>
 
     </script>
 
+
</br></br></br>
 
</html>
 
</html>
 
{{KU_Leuven_footer}}
 
{{KU_Leuven_footer}}

Latest revision as of 01:01, 1 November 2017


Protocols

In the lab, we used different experimental procedures. There are protocols for the wet and bacterial lab, for the cell culture lab and for the electrophysiology lab.

Cell Culture


Wet Lab


Patch Clamp


Calcium imaging


Intra- and extracellular buffers